This work was funded by the German Ministry of Defense (Grant No. M-SAB1-6-A009).

Le protocole suivant décrit les techniques pour l&#39;enquête de début de la migration des cellules endothéliales. La bonne culture des cellules endothéliales vasculaires nécessite pré-revêtement de flacons de culture cellulaire avec la gélatine pour assurer la prolifération et l&#39;entretien d&#39;un phénotype endothélial. 1. Pré-revêtement de flacons de culture cellulaire <ol><li> Dissoudre la gélatine dans du PBS 0,1 M à une concentration finale de 0,1%. </li><li> Autoclave la solution avec des paramètres pour autoclavage liquide (pour plus de détails voir les instructions de l&#39;autoclave spécifique). </li><li> Ajouter un volume suffisant de la solution de gélatine à l&#39;autoclave dans un ballon de culture cellulaire stérile (par exemple, au moins 5 ml pour un flacon de culture de cellules T25). </li><li> Transférer les flacons dans un incubateur (37 ° C, 5% CO 2 ne soit pas requis, mais ne gêne pas) pendant au moins 30 min. </li><li> Retirer la solution de gélatine restant. Utilisez les flacons pré-enduit ensuite (voir la culture de cellules) ou sdéchiré dans des conditions stériles jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 2. Culture cellulaire des premières cellules endothéliales Note: cellule souche embryonnaire dérivée des cellules endothéliales début (CEE) ont été obtenues à partir des corps embryoïdes murins différenciées par tri magnétique de cellules activées de la fraction de cellules positives PECAM-1 comme décrit précédemment 10,11. <ol><li> Culture CEE sur des boîtes de culture de cellules revêtues de gélatine dans du DMEM supplémenté avec 15% de FCS, 50 U / ml de pénicilline, 50 U / ml de streptomycine, 200 uM de L-glutamine, 100 pM de ß-mercaptoéthanol et 1% d&#39;acides aminés non essentiels. Poignée cellules dans des conditions stériles. Cultiver les cellules avec 5% de CO2 à 37 ° C et 95% d&#39;humidité jusqu&#39;à ce que la sous-confluence (max. 80%). </li><li> Au sous-confluence, les cellules à séparer un rapport de 1: 5. Remarque: Le détachement des cellules endothéliales est une étape critique. <ol><li> Récolter les cellules avec RT Accutase. Retirez les médias, rincer avec du PBS et ajouter 1 ml de Accutase par 25 cm <sup&gt; 2. </li><li> Incuber le flacon à température ambiante pendant 2-10 min jusqu&#39;à ce que les cellules ont détaché. Disperser les cellules et de les transférer à l&#39;application souhaitée. Remarque: Une neutralisation chimique de l&#39;Accutase est pas nécessaire, car il a lieu lorsque les cellules ensemencées sont stockés dans l&#39;incubateur à 37 ° C. Cependant, Accutase activité peut également être diminuée par l&#39;addition du milieu DMEM contenant du FCS. </li></ol></li></ol> 3. Boyden Chambre Remarque: Les dosages de la chambre de Boyden sont effectuées en utilisant des systèmes d&#39;insertion de polyéthylène téréphtalate opaque à la lumière 8 um de taille de pore. <ol><li> Pré-enduire les inserts de filtre (qui coupe à l&#39;intérieur des puits de culture de cellules, créant ainsi une chambre de Boyden) en ajoutant 500 ul de 0,1% de gélatine dissous dans 0,1 M de PBS pendant au moins 30 min. </li><li> Si les cellules doivent être exposées à des produits chimiques toxiques, selon exposer à la conception expérimentale spécifique avant la récolte des cellules. Note: Les cellules ont été exposées à 12,5 ug chlorambucil / ml de DMEMpendant 24 heures. En ce qui concerne la conception expérimentale spécifique, des instructions peuvent varier. </li><li> Récolte CEE et déterminer le nombre de cellules en utilisant une chambre de comptage de cellules. Remarque: Les appareils de comptage automatiques peuvent être utilisés, mais doivent être utilisés avec prudence: le comptage manuel des cellules est plus précise et est fortement recommandé. </li><li> Ajouter 500 pi de milieu de culture de cellules dans le compartiment de la chambre inférieure de la chambre de Boyden. </li><li> Ajouter exactement 10 4 500 ul CEE dans un milieu de culture de cellules par insert de filtre dans le compartiment de la chambre supérieure. Éliminer les bulles. </li><li> Incuber les inserts de filtre dans l&#39;incubateur pendant exactement 8 h. </li><li> Rincer une fois avec du PBS et remplacer le milieu par 0,5 ml de paraformaldehyde à 4% dans les deux compartiments pendant 25 minutes pour la fixation des cellules. Laver le filtre largement mais au moins trois fois avec du PBS 0,1 M. </li><li> Exciser les membranes avec un scalpel. </li><li> Monter la membrane entre deux lamelles de verre avec un milieu de montage contenant DAPI pour stainin nucléaireg. Faites attention à l&#39;orientation. Assurez-vous que seules les cellules qui ont migré vers le côté du compartiment inférieur de la membrane sont comptées. </li><li> Compter les cellules qui ont migré vers le côté du compartiment inférieur de la membrane avec un microscope à fluorescence à un grossissement de 400X. Ne confondez pas les pores de la membrane avec des cellules migrées (Figure 1A, 1B). Enquêter sur un nombre raisonnable de répétitions biologiques (au moins 3 répétitions biologiques par condition). </li></ol> 4. Wound Healing Assay <ol><li> Selon l&#39;équipement disponible, choisissez avec soin les plats ou des plaques de culture cellulaire: Lorsque vous utilisez microscopie DIC, éviter des boîtes de culture à base de surface en plastique ou des plaques ainsi, mais utiliser des dispositifs à base de verre à la place. Remarque: Si en utilisant la microscopie à contraste de phase, plats de plastique à base peuvent également être utilisés. </li><li> Cultiver CEE dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, 4 cm à fond de verre boîte de Pétri approprié pour l&#39;imagerie des cellules vivantes) Jusqu&#39;à 80% de confluence. Important: ne pas cultiver les cellules pour compléter confluence. </li><li> Grattez les monocouches avec stériles 10 conseils ul de pipettes. Poussez la pointe doucement sans trop de pression sur la surface de la boîte et de le déplacer en ligne droite en douceur d&#39;un côté à l&#39;other.Wash les cellules deux fois avec 0,1 M de PBS pour éliminer les cellules individuelles. </li><li> Ajouter un volume suffisant de milieu de la boîte de culture. Le cas échéant, ajouter des composés qui devraient être étudiés. Note: 1,5 ml de milieu contenant 15 ng / ml alpha a été ajouté de l&#39;acide linolénique. </li><li> Monter la boîte de culture sous un microscope capable d&#39;imagerie des cellules vivantes. Veiller à 5% de CO 2, 37 ° C et une atmosphère humidifiée. Remarque: L&#39;humidification est particulièrement important pour éviter l&#39;évaporation moyenne. </li><li> Acquérir les images de time-lapse de plus de 24 heures à intervalles de 10 minutes. Plan pour les grandes tailles de fichiers. Remarque: Une résolution de 512 x 512 pixels est généralement suffisant; Toutefois, nous vous recommandons d&#39;utiliser des images d&#39;au moins 1024 x 1,024. </li><li> Mesurer la largeur de la fente à t = 0 h et à t = 24 h en utilisant l&#39;outil de longueur du logiciel fourni avec le microscope ou utiliser des logiciels open-source (par exemple, ImageJ). Remarque: Dans le logiciel générale d&#39;acquisition et d&#39;analyse d&#39;image spécifique est fourni par le fabricant. Par conséquent, pour les détails techniques concernant l&#39;utilisation du logiciel, reportez-vous au manuel. </li></ol> Suivi 5. cellulaire <ol><li> Selon l&#39;équipement disponible, choisissez avec soin les plats ou des plaques de culture cellulaire: Lorsque vous utilisez microscopie DIC, éviter des boîtes de culture à base de surface en plastique ou des plaques ainsi, mais utiliser des dispositifs à base de verre à la place. Remarque: Si en utilisant la microscopie à contraste de phase, plats de plastique à base peuvent également être utilisés. </li><li> Seed 5 x 10 4 CEE complétée DMEM dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, plaque de 24 puits multiples) et de cultiver les cellules avec 5% de CO 2 à 37 ° C et 95% d&#39;humidité pendant 1-2 jours. </li><li> Lorsque les cellules ont grandi à un 80% De confluence, retirez les médias et la culture des cellules avec les nouveaux médias dans la présence de substances d&#39;essai respectifs (par exemple, 12,5 pg chlorambucil / ml DMEM). Toujours inclure les cellules de contrôle (traitées avec le solvant, par exemple l&#39;éthanol) à 37 ° C pendant une certaine période de temps (24 heures, selon le système de test individuel). </li><li> Monter la boîte de culture sous un microscope capable de l&#39;imagerie des cellules vivantes (37 ° C, 5% de CO 2 et 95% d&#39;humidité). Acquérir les images de time-lapse de plus de 24 heures à des intervalles prédéfinis. Acquérir des images à intervalles de 10 min. </li><li> Effectuer le suivi manuellement des CEE par l&#39;utilisation du plugin ImageJ MTrackJ. Choisissez 10 cellules au hasard dans le champ de vision et de suivre leurs mouvements en ajoutant un point de données par point dans le temps en utilisant le &quot;Ajouter&quot; commandement de MTrackJ. </li></ol> Remarque: MTrackJ est disponible gratuitement à et ImageJ est disp [Meijering, Mtrackj &quot;http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/&quot;.]le à [Rasband, imagej. &quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/&quot;]. Un manuel détaillé sur le plugin MTrackJ est disponible au &quot;http://www.imagescience.org&quot;. 6. imagerie de cellules vivantes / évaluation du potentiel de membrane mitochondriale <ol><li> Cultiver CEE dans un dispositif de culture de cellules approprié (par exemple, 4 cm bas boîte de Pétri en verre approprié pour l&#39;imagerie de cellules vivantes) jusqu&#39;à une confluence de 80%. Important: Ne pas cultiver les cellules pour compléter confluence. </li><li> Le cas échéant, exposer les cellules à des produits chimiques. Note: Les cellules ont été exposées à 12,5 pg / ml pendant 24 heures chlorambucil. En ce qui concerne la conception expérimentale spécifique, des instructions peuvent varier. </li><li> Préparer une solution à 10 mM du stock de tétraméthylrhodamine (TMRM) dans le DMSO. Protéger de la lumière. Remarque: La solution stock peut être conservé à -20 ° C. </li><li> Diluer la solution mère dans un milieu de culture de cellules à une solution de travail avec une concentration de 10 uM (1: 1000 dilution). Protéger de la lumièreet d&#39;utiliser dès que possible. Remarque: La solution de travail peut être conservé à température ambiante pendant un certain temps (&gt; 1 h), cependant, la préparation d&#39;une solution de travail frais est fortement recommandée. </li><li> Ajouter 2 ul de la solution de travail à 1 ml de milieu (solution de charge) de culture cellulaire frais. </li><li> Charger les cellules en remplaçant le milieu de culture de cellules avec la solution de charge. Incuber pendant 15 min à 37 ° C, 5% CO 2 et une atmosphère humidifiée (incubateur). Attention: Presque tous les indicateurs de fluorescence sont exportés par les cellules plus de temps à vivre; donc éviter de chargement prolongée ou retardée analyse. </li><li> Sans lavage, placez le plat sous un microscope convenant pour l&#39;imagerie de cellules vivantes. Important: indicateurs de fluorescence sont très sensibles à la lumière, par conséquent, éviter l&#39;exposition inutile de lumière. </li><li> Acquérir des images sans modifier les paramètres d&#39;acquisition pour assurer la comparabilité entre les différentes images. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

L&#39;exposition cutanée à des produits chimiques toxiques se traduit souvent par des troubles de cicatrisation sévère. Les mécanismes sous-jacents sont largement inconnues. La cicatrisation des plaies est un processus complexe qui se compose de différentes phases (hémostase, inflammation, prolifération et remodelage). La migration cellulaire est impliquée dans toutes les étapes, cependant, il est de la plus haute importance pour la formation du tissu de granulation. Ici, de nouveaux vaisseaux sanguins sont fo...

La migration cellulaire est important dans de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques y compris le développement, diverses maladies, et la cicatrisation après une blessure de la peau. Après une lésion de la peau, une inflammation des tissus durs supprime granulation et endommagées ou nécrotiques préliminaire fermeture de plaie et permet la formation d&#39;un réseau de nouveaux capillaires à travers la vasculogenèse (formation novel) ou l&#39;angiogenèse (bourgeonnement de vésicules existants) 3.1. Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse migration des cellules endothéliales. Le réseau croissant de vaisseaux sanguins est essentielle pour le transport de l&#39;oxygène et des nutriments à la prolifération des kératinocytes qui subissent finalement kératinisation, former un nouvel épithélium et de fournir fermeture de la plaie. La migration des cellules endothéliales avec facultés affaiblies est une cause sous-jacente de cicatrisation 4,5 trouble. Ainsi, les méthodes pour évaluer la migration des cellules endothéliales premiers sont nécessaires pour explorer le pathophysiolgie des troubles de la migration cellulaire et d&#39;identifier de nouvelles stratégies d&#39;intervention thérapeutique. L&#39;exposition cutanée aux agents alkylants (par exemple, de soufre et d&#39;azote moutardes) provoque la cicatrisation trouble 6. Ces composés ont été utilisés comme agents de guerre chimique dans plusieurs conflits dans le 20ème siècle et restent raison de vives préoccupations en raison de stocks existants dans des régions politiquement instables et la synthèse relativement simple. Bien que le gaz moutarde a été synthétisé pour la première en 1822, la pathologie moléculaire et clinique de l&#39;exposition SM ne soit pas compris dans le détail et aucun antidote pour l&#39;exposition SM a été identifié. Plusieurs études ont été menées afin de comprendre et de modéliser la guérison des plaies après une exposition de SM et de tester des composés candidats potentiels capables de réserver cet effet. Schmidt et al. (2009) ont testé l&#39;effet de chlorambucil, un composé alkylant avec des propriétés similaires à SM dans mousoi modèles de corps embryoïdes et trouvé une dramatique, réduction parfois plus de 99% dans la formation de vaisseaux 7. Cet effet indésirable est le plus prononcé à un stade de développement qui, dans des conditions physiologiques, est dominé par la prolifération et la migration des cellules précurseurs endothéliales vasculaires. Ainsi, ces cellules ont été identifiés comme étant particulièrement sensible aux agents d&#39;alkylation. Steinritz et al. (2010) ont testé piégeurs de formes réactives de l&#39;oxygène (ROS), en particulier, la N-acétylcystéine (NAC) et de l&#39;acide alpha-linolénique (ALA) pour leur capacité à réduire la toxicité SM dans les modèles de l&#39;organisme de la souris embryoïdes et en particulier, à restaurer la formation de vaisseaux 8. Effets protecteurs temporaires ont été observés, ce qui indique que la formation excessive ROS était susceptible de contribuer aux effets néfastes de SM sur la cicatrisation. Ces effets ne sont pas permanentes et les deux composés candidats peuvent ne pas être capable de restaurer la formation des vaisseaux et la cicatrisation dans le long terme 8. However, ces expériences ont été menées dans un modèle 3D complexe qui a fait de permettre une enquête de la migration cellulaire. Ainsi, nous avons ensuite testé CNA et de l&#39;ALA pour les effets bénéfiques sur la migration des cellules de la CEE qui ont un rôle clé dans le processus de la formation de vaisseaux 9. En outre, il est prouvé que la polarité cellulaire est nécessaire pour la migration des cellules. Dysfonction mitochondriale conduisant à la formation de ROS a été montré à porter atteinte à la polarité cellulaire et peut donc nuire à la migration cellulaire. Par conséquent, imagerie des cellules vivantes à l&#39;égard de la fonction mitochondriale a été effectuée et les effets de charognards ROS ont été examinés. Le protocole suivant décrit les exigences générales pour la culture de la CEE, le dosage de la chambre de Boyden, la cicatrisation dosage y compris l&#39;analyse de suivi de la cellule et l&#39;utilisation de TMRM pour l&#39;évaluation de la fonction mitochondriale en détail. Les aspects importants de protocoles expérimentaux pour la culture et la migration CEE sont mis en évidence.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Boyden Chamber&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 &#181;m</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>#351151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 &#181;m</td>
			<td>Life Sciences</td>
			<td>#351152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound&#160; healing assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Word Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>#FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assessment of mitochondrial potential</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>#T669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>PAA, Pasching, Austria</td>
			<td># L11-007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Linolenic acid</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td>&#160;# L2376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorambucil</td>
			<td>Fluka (Sigma), Steinheim, Germany</td>
			<td># 23125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany</td>
			<td># G2500-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of endothelial cell migration after exposure to toxic chemicals

L&#39;exposition à des substances chimiques (y compris les agents alkylants de guerre chimiques tels que les moutardes à l&#39;azote et soufre) provoque une grande variété de symptômes cliniques, y compris le trouble de guérison de la plaie. Le processus physiologique de cicatrisation de la plaie est très complexe. La formation de tissu de granulation est une étape clé dans ce processus résultant dans un avant fermeture de la plaie et de fournir un réseau de nouveaux vaisseaux sanguins capillaires - soit par vasculogenèse (formation de roman) ou angiogenèse (la germination des navires existants). Les deux vasculo- et nécessitent une angiogenèse fonctionnel, la migration dirigée des cellules endothéliales. Ainsi, l&#39;enquête du début de cellules endothéliales (CEE) la migration est important de comprendre la physiopathologie de la plaie chimique induite par les troubles de guérison et de potentiellement identifier de nouvelles stratégies d&#39;intervention thérapeutique. Nous avons évalué la guérison des plaies après alkylation exposition de l&#39;agent et testé des composés candidats potentiels pour traitement. Nous avons utilisé un ensemble de techniques décrites dans ce protocole. Une chambre de Boyden modifiée pour enquêter quantitativement chimiokinèse des CEE est décrite. En outre, l&#39;utilisation de la cicatrisation dosage en combinaison avec l&#39;analyse de piste afin d&#39;évaluer qualitativement la migration est illustré. Enfin, nous démontrons l&#39;utilisation de la TMRM de colorant fluorescent pour l&#39;enquête du potentiel de membrane mitochondriale pour identifier les mécanismes sous-jacents de la migration cellulaire perturbé. Le protocole suivant décrit les techniques de base qui ont été adaptés pour l&#39;étude des CEE.

L&#39;exposition cutanée à des agents d&#39;alkylation provoque l&#39;érythème, la formation de cloques et une ulcération cutanée qui est associé à un trouble de la cicatrisation des plaies. La cicatrisation des plaies nécessite vasculogénèse angiogenèse et qui sont basées sur la migration des cellules endothéliales. Quantitative migration peut être évaluée en utilisant le dosage de la chambre de Boyden. Comme le montre la figure 1C de l&#39;exposition de la CEE au chlorambucil agent al...

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Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Évaluation de la migration des cellules endothéliales après une exposition à des produits chimiques toxiques

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.6K vues.  Bundeswehr Institute of Pharmacology and Toxicology. Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

Vidéo: Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Zebrafish Keratocyte Explants to Study Collective Cell Migration and Reepithelialization in Cutaneous Wound Healing

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell migration. However, when explants are established, these cells also move collectively, maintaining many of the features which make individual keratocytes an attractive model to study migration: rapid rates of motility, extensive actin-rich lamellae with a perpendicular actin cable, and relatively constant speed and direction of migration. In early explants, the rapid interconversion of cells migrating individually with those migrating collectively allows the study of the role of cell-cell adhesions in determining the mode of migration, and emphasizes the molecular links between the two modes of migration. Cells in later explants lose their ability to migrate rapidly and collectively as an epithelial to mesenchymal transition occurs and genes associated with wound healing and inflammation are differentially expressed. Thus, keratocyte explants can serve as an in vitro model for the reepithelialization that occurs during cutaneous wound healing and can represent a unique system to study mechanisms of collective cell migration in the context of a defined program of gene expression changes. A variety of mutant and transgenic zebrafish lines are available, which allows explants to be established from fish with different genetic backgrounds. This allows the role of different proteins within these processes to be uniquely addressed. The protocols outlined here describe an easy and effective method for establishing these explant cultures for use in a variety of assays related to collective cell migration.

Zebrafish keratocytes migrate in cell sheets from explants and provide an in vitro model for the study of the mechanisms of collective cell migration in the context of epithelial wound healing. These protocols detail an effective way to establish primary explant cultures for use in collective cell migration assays.

Poisson zèbre kératocyte explants d&#39;étudier la migration cellulaire collective et réépithélialisation dans la cicatrisation cutanée plaies

Due to their unique motile properties, fish keratocytes dissociated from explant cultures have long been used to study the mechanisms of single cell ...

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Biologie du développement

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and inflammatory responses. Given the current interest in the role of mesenchymal stromal cells in mediating tissue repair, we are interested in quantifying the migratory capacity of these cells, and understanding how migratory capacity may be altered after damage. Optimization of a rigorously quantitative migration assay that is both easy to customize and cost-effective to perform is key to answering questions concerning alterations in cell migration in response to various stimuli. Current methods for quantifying cell migration, including scratch assays, trans-well migration assays (Boyden chambers), micropillar arrays, and cell exclusion zone assays, possess a range of limitations in reproducibility, customizability, quantification, and cost-effectiveness. Despite its prominent use, the scratch assay is confounded by issues with reproducibility related to damage of the cell microenvironment, impediments to cell migration, influence of neighboring senescent cells, and cell proliferation, as well as lack of rigorous quantification. The optimized scratch assay described here demonstrates robust outcomes, quantifiable and image-based analysis capabilities, cost-effectiveness, and adaptability to other applications.

The capacity to migrate is a key function of many different cell types, including mesenchymal stromal cells (MSCs). However, quantifying alterations in migratory capacity after damage is challenging. This protocol describes an easily adaptable migration assay that uses rigorous statistics to quantify changes in MSC migratory capacity after damage.

Optimisation du dosage Blessure Scratch pour détecter les changements dans murin mésenchymateuses stromales migration cellulaire Après Dommages par Soluble Extrait Cigarette Smoke

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Épicardique Excroissance Culture Assay et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Évaluation des épicardique dérivés Migration cellulaire

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

en cours d&#39;analyse<em&gt; In Vivo</em&gt; Migration cellulaire en utilisant Transplantations cellulaires et imagerie time-lapse en Zebrafish Embryons

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Une nouvelle technique de transplantation de graisse mammaire mammaire pour visualiser la génération de vaisseaux de cellules souches endothéliales vasculaires

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including embryogenesis and development, wound healing, tumor growth and metastasis, and ocular and cardiovascular diseases. Effective in vitro models that recapitulate the biology of angiogenesis are needed to appropriately study this process and identify mechanisms of regulation that can be ultimately targeted for novel therapeutic strategies. The bead angiogenesis assay has been previously demonstrated to recapitulate the multiple stages of endothelial sprouting in vitro. However, a limitation of this assay is a lack of endothelial &#8211; mural cell interactions, which are key to the molecular and phenotypic regulation of endothelial cell function in vivo. The protocol given here presents a methodology for the incorporation of mural cells into the bead angiogenesis assay and demonstrates a tight association of endothelial cells and pericytes during sprouting in vitro. The protocol also details a methodology for effective silencing of target genes using siRNA in endothelial cells for mechanistic studies. Altogether, this protocol provides an in vitro assay that more appropriately models the diverse cell types involved in sprouting angiogenesis, and provides a more physiologically-relevant platform for therapeutic assessment and novel discovery of mechanisms of angiogenesis regulation.

This protocol presents a novel in vitro bead assay that more appropriately models the process of in vivo sprouting angiogenesis by incorporating pericytes. This modification enables the bead assay to more faithfully recapitulate the heterotypic cellular interactions between endothelial cells and mural cells that are critical for angiogenesis.

Incorporer les péricytes dans une perle de cellules endothéliales test de germination

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture can be recorded under video microscopy. For analyzing cell migration in the developing brain, slice culture is commonly used to observe cell migration parallel to the slice section, such as radial cell migration. However, limited information can be obtained from the slice culture method to analyze cell migration perpendicular to the slice section, such as tangential cell migration. Here, we present the protocols for time-lapse imaging to visualize tangential cell migration in the developing chick optic tectum. A combination of cell labeling by electroporation in ovo and a subsequent flat-mount culture on the cell culture insert enables detection of migrating cell movement in the horizontal plane. Moreover, our method facilitates detection of both individual cell behavior and the collective action of a group of cells in the long term. This method can potentially be applied to detect the sequential change of the fluorescent-labeled micro-structure, including the axonal elongation in the neural tissue or cell displacement in the non-neural tissue.

We describe the methods for fluorescent labeling of tangentially migrating cells by electroporation, and for time-lapse imaging of the labeled cell movement in a flat-mount culture in order to visualize migrating cell behavior in the developing chick optic tectum.

Visualisation de la Migration cellulaire tangentielle dans le Tectum optique de poussin en développement

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidique analyse pour l’évaluation de l’adhésion leucocytaire à humaine Induced Pluripotent Stem Cell dérivé des cellules endothéliales (hiPSC-ce)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

Tests in Vitro pour évaluer la Migration, Invasion et la prolifération de lignées cellulaires immortalisées humaine au premier trimestre trophoblaste

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...