Comprendre comment les astrocytes se développent et établissent leur morphologie complexe est essentiel pour comprendre comment le cerveau se développe et fonctionne. Ce protocole décrit comment analyser les aspects clés de la morphologie des astrocytes dans le tissu cérébral. Ce protocole utilise un code personnalisé pour mesurer le volume du territoire des astrocytes dans des sections de tissus épais.
Cette stratégie peut également être appliquée pour mesurer la quantité de chevauchement de territoire entre les astrocytes voisins. En combinant ce protocole avec la manipulation génétique des astrocytes, les chercheurs peuvent étudier directement le rôle de protéines et de voies spécifiques dans le développement des astrocytes et l’interaction astrocyte-astrocyte Pour commencer, préparez une nouvelle solution de TBST en ajoutant 1 millilitre de 10% de Triton X à un tube de 50 millilitres et en remplissant le tube de 50 millilitres avec TBS. Préparez 2 millilitres de solutions de blocage et d’anticorps pour chaque cerveau en combinant le sérum de chèvre et le TBST dans un Tube de 15 millilitres.
Ensuite, étiquetez une plaque de 24 puits pour placer différents échantillons dans différentes rangées dans différentes solutions dans différentes colonnes, puis ajoutez un millilitre de TBST aux trois premières colonnes étiquetées comme lavage 1, lavage 2 et lavage 3, et ajoutez 1 millilitre de solution bloquante à la quatrième colonne. Préparez un pic à verre en faisant fondre l’extrémité d’une pipette Pasteur de 5,75 pouces dans un petit crochet à l’aide d’un brûleur Bunsen, puis transférez les sections de tissu de la plaque de 12 puits dans la colonne de lavage 1 de la plaque de 24 puits à l’aide du pic, puis lavez les sections pendant 10 minutes chacune dans le lavage 1, 2, et 3 puits en utilisant le pic à verre pour transférer les sections d’un puits à l’autre, suivi de l’incubation des sections pendant une heure dans la solution de blocage. Préparer q millilitre de solution d’anticorps primaire en ajoutant l’anticorps à la solution d’anticorps, puis vortex brièvement et centrifuger pendant 5 minutes à plus ou égal à 4 000 fois g à 4 degrés Celsius.
Ensuite, incubez les sections dans un anticorps primaire pendant 2 à 3 nuits à 4 degrés Celsius tout en secouant. Après l’incubation des anticorps primaires, aspirer le TBST du jour 1 des puits de lavage, puis ajouter 1 millilitre de nouveau TBST à chaque puits de lavage et déplacer les sections dans le premier puits de lavage. Ensuite, incuber des sections dans un anticorps secondaire pendant 3 heures à température ambiante.
Après l’incubation secondaire des anticorps, aspirer le TBST du jour 2 des puits de lavage, puis ajouter 1 millilitre de nouveau TBST à chaque puits de lavage et déplacer les sections dans le premier puits de lavage. Pendant le lavage final, retirez le support de montage de 4 degrés Celsius et laissez-le chauffer à la température ambiante, puis préparez un mélange 2 à 1 de TBS et d’eau désionisée et ajoutez-le à une boîte de Pétri. Ensuite, préparez une lame de microscope en ajoutant 800 microlitres de mélange 2 à 1 de TBS et d’eau désionisée à la surface.
Transférez les sections du puits de lavage 3 à la boîte de Pétri, puis à l’aide d’un pinceau fin, transférez les sections une à la fois de la boîte de Pétri dans le liquide sur la glissière. Ensuite, organisez soigneusement les sections de manière à ce qu’elles soient plates sur la diapositive à l’aide du pinceau. Retirez soigneusement l’excès de liquide de la glissière avec une pipette P-1000, suivie d’une aspiration sous vide.
Une fois que tout l’excès de liquide est retiré de la glissière, utilisez une pipette de transfert pour ajouter immédiatement 1 goutte de support de montage à chaque section et déposez doucement un couvercle sur la glissière. Laissez le support de montage se répandre pendant quelques minutes, puis retirez tout support de montage excédentaire qui sort de sous le couvercle par aspiration sous vide. Ensuite, scellez les quatre bords du couvercle avec du vernis à ongles transparent.
Laissez sécher les lames pendant 30 minutes à température ambiante, puis conservez-les à plat à 4 degrés Celsius. À l’aide d’un objectif 10x, localisez les cellules individuelles pour l’imagerie et notez la région ou la sous-région spécifique du cerveau pertinente pour l’expérience, puis à l’aide du bouton de mise au point, déterminez si l’astrocyte entier est contenu dans la section. Ensuite, passez à un objectif d’huile à grossissement plus élevé et mettez la cellule au point.
Lorsque vous regardez à travers l’oculaire, utilisez le bouton de mise au point pour vous déplacer du haut vers le bas de la cellule, puis inspectez visuellement la cellule pour vous assurer que toute la cellule est contenue dans la section. À l’aide du logiciel d’acquisition associé aux microscopes confocaux, ajustez les paramètres d’acquisition pour obtenir un rapport signal/bruit et un niveau de détail appropriés, puis utilisez un zoom 2x pour un objectif 40x et aucun zoom si vous utilisez un objectif 60x ou 63x. Définissez les limites supérieure et inférieure de la pile Z avec une taille de pas de 0,5 micromètre en veillant à ce que l’ensemble de l’astrocyte soit capturé avec la première et la dernière image sans aucun marquage fluorescent de la cellule.
Avant de commencer l’analyse, installez le fichier d’extension de coque convexe, XtspotsConvexHull, en collant le fichier dans le sous-dossier rtmatlab du dossier XT. À l’aide du convertisseur de fichiers Imaris, convertissez les images au format IMS. Ensuite, ouvrez un fichier image dans le logiciel d’analyse d’image et sélectionnez le bouton Vue 3D pour afficher l’image en mode 3D, en vous assurant que la cellule répond aux critères d’inclusion.
Pour créer une surface, cliquez sur l’icône bleue Ajouter de nouvelles surfaces, puis créez une région d’intérêt autour de la cellule en entrant des cotes dans les zones sous taille de l’outil de création de surface ou en faisant glisser les bords de la zone jaune. Ensuite, ajustez l’intensité absolue du seuil en faisant glisser la barre jaune ou en entrant des valeurs dans la zone afin que la surface grise remplisse autant que possible le signal de la cellule sans dépasser les limites de la cellule. Ensuite, cliquez sur la flèche verte pour terminer la génération de la surface.
Inspectez soigneusement la surface nouvellement générée et supprimez toutes les pièces de surface qui ne font pas partie de la cellule en les sélectionnant, puis en cliquant sur l’outil Édition au crayon suivi de l’option Supprimer. Pour unifier les pièces de surface restantes, cliquez sur l’icône Filtre en entonnoir pour tout sélectionner, puis cliquez sur l’icône Modifier le crayon et sélectionnez l’option Unifier. Cliquez sur l’icône orange Ajouter de nouveaux points et sélectionnez le canal source correct dans la liste déroulante, puis entrez une valeur de diamètre XY estimée à 0,400 micromètre dans la boîte.
Ensuite, cliquez sur la flèche verte pour terminer la création des taches, puis resélectionnez les taches. Cliquez sur l’icône Filtre et sélectionnez Distance la plus courte par rapport aux surfaces Surfaces X où surfaces X est la surface analysée dans la liste déroulante, en vous assurant que les boutons d’alimentation du seuil inférieur et du seuil supérieur sont verts. Ensuite, entrez une distance minimale de moins 1,0 micromètre dans la zone de seuil inférieure et une distance maximale de 0,1 micromètre dans la zone de seuil supérieure, puis cliquez sur le bouton Dupliquer la section vers de nouveaux points, en vous assurant que les points nouvellement créés sont sélectionnés dans le panneau supérieur gauche de la fenêtre du logiciel.
Ensuite, cliquez sur l’icône Outils d’engrenage, puis cliquez sur le plugin Convex Hull une seule fois et attendez que la fenêtre MATLAB apparaisse, puis disparaisse, ce qui donne une coque solide dans la vue 3D. Dans le panneau supérieur gauche, assurez-vous que Coque convexe de spots X Selection, Shortest Distance où Spots X Selection est le Spots nouvellement créé est sélectionné, puis cliquez sur la coque pour le sélectionner. Ensuite, cliquez sur l’icône Statistiques graphiques.
Dans l’onglet Sélection, assurez-vous que Valeurs spécifiques est sélectionnée dans la liste déroulante supérieure, puis choisissez Volume dans la liste déroulante inférieure, puis enregistrez le volume de la coque et enregistrez le fichier, en passant à l’image suivante. Le volume du territoire des astrocytes a été mesuré dans les astrocytes exprimant une protéine fluorescente rouge ciblée sur la membrane. L’élimination de la molécule d’adhésion cellulaire enrichie en astrocytes, l’hépaCAM, réduit considérablement le volume du territoire des astrocytes.
L’analyse en mosaïque avec des marqueurs doubles a été utilisée pour générer des souris où les astrocytes de type sauvage expriment une protéine fluorescente rouge et les astrocytes knockout hepaCam expriment une protéine fluorescente verte. Le pourcentage de chevauchement de territoire entre les paires d’astrocytes de protéines fluorescentes rouges et vertes voisines a été calculé. Les souris avec modification génétique de l’hépaCAM et des astrocytes verts ont montré un pourcentage significativement accru du volume de chevauchement du territoire avec leurs voisins rouges de type sauvage par rapport aux paires d’astrocytes de type sauvage seulement.
Ce résultat démontre que l’hépaCAM est nécessaire pour le volume normal du territoire des astrocytes et le carrelage des astrocytes. Il est essentiel de s’assurer que la cellule répond aux critères d’inclusion. Une cellule incomplète aura un volume de territoire plus petit et peut affecter vos résultats et conclusions globaux.
