The authors are financially supported by the Swiss National Science Foundation through an operating grant N&#176; 31003A-149566 (to N.D.), and The Sir Jules Thorn Charitable Overseas Trust through a Young Investigator Subsidy (to P.N.).

Déclaration éthique: Toutes les manipulations d&#39;animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les directives du Comité de recherche animale de l&#39;Université de Genève. 1. Préparation des cibles phagocytaires <ol><li> Ajouter 20 mg de zymosan séché à 10 ml de solution saline stérile de phosphate tamponnée (PBS). Vortex et à la chaleur dans un bain d&#39;eau bouillante pendant 10 min. Refroidir et centrifuger à 2000 g pendant 5 min. </li><li> Retirer le surnageant, remettre en suspension dans 1 ml de PBS et de traitement par ultrasons pendant 10 minutes dans un sonicateur à bain-marie. Transférer 500 ul de deux tubes de 1,5 ml. Centrifuger à 11 000 g pendant 5 min. </li><li> Répétez le lavage avec 500 pi de PBS. Le zymosan bouillie peut être aliquoté, congelé et stocké à -20 ° C. </li><li> Laver deux fois le zymosan dans 500 ul fraîchement préparées 0,1 M de Na 2 CO 3, pH 9,3 comme ci-dessus (étape 1.2). </li><li> Remettre en suspension dans 490 pi après le lavage final. Ajouter 10 ul de 10 mg / ml dissous dans FITC diméthyl sulfoxide (DMSO), vortex, couvrir de papier, et incuber sous agitation pendant 4 heures à température ambiante. </li><li> Pour supprimer le colorant non lié, laver comme ci-dessus (étape 1.2), d&#39;abord avec 0,5 ml de DMSO + 150 pi de PBS, puis 0,5 ml de DMSO + 300 pi de PBS, puis 0,5 ml de DMSO + 450 pi de PBS, puis PBS seul. </li><li> Comptez zymosane utilisant un hémocytomètre. Ajouter 1 pi de zymosan à 500 ul de PBS, vortex, puis ajouter 10 ul du bord de la chambre d&#39;hémocytomètre, où elle rencontre la lamelle couvre-objet placé sur la grille centrale. Montez le hémocytomètre sur un microscope à champ lumineux équipé d&#39;un objectif 20X. </li><li> Concentrez-vous sur le coin supérieur gauche contenant 16 carrés et compter toutes les particules de zymosan dans ce domaine en utilisant un compteur à main. Répéter l&#39;opération avec le coin inférieur droit. Calculer la concentration zymosane utilisant l&#39;équation suivante: concentration Zymosan = comte / 2 x 500 x 10 4 zymosane / ml. Zymosane marqué peut être aliquoté, congelé et stocké à -20 ° C. </li><li> Opsoniser le wi zymosane marquéth un anticorps anti-lapin zymosan à 1: 100 dilution. Vortex et incuber pendant 1 heure dans un bain d&#39;eau à 37 C °. Laver avec 500 pi de PBS comme ci-dessus (étape 1.2). Remarque: Le traitement par ultrasons est fortement recommandé, surtout après opsonisation, comme zymosane tend à former des amas qui peuvent rendre plus difficile l&#39;analyse plus tard. Opsonisation avec 65% v / v de sérum humain ou de rat peut être utilisé comme une alternative. </li><li> Comptez zymosane utilisant un hémocytomètre comme décrit dans les étapes 1,7-1,8, et diluer à 100 x 10 6 particules / ml. Opsonisation avec d&#39;autres stimulateurs phagocytaires, comme complément ou pas opsonisation, peut également être réalisé. </li></ol> 2. Live Video Microscopy <ol><li> Isoler neutrophiles primaires de souris comme décrit en détail par ailleurs 38. <ol><li> Vous pouvez également utiliser n&#39;importe quel type de cellule phagocytaire. Gardez neutrophiles sur la glace à Roswell Institut Memorial Park (RPMI) 1640 milieu supplémenté avec 5% de sérum de veau foetal (v / v), 200 U de pénicilline / streptomycin, à une concentration de 10 x 10 6 cellules / ml jusqu&#39;à utilisation. D&#39;autres types de cellules peuvent être ensemencées 1-4 jours avant. </li></ol></li><li> Ajouter 2 x 10 5 (20 ul) de neutrophiles au centre d&#39;une boîte à fond de verre 35 mm, étaler la goutte par addition de 50 ul de milieu et on incube à 37 ° C pendant 5 minutes pour permettre aux cellules d&#39;adhérer. </li><li> Ajouter 1 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) chauffé à 37 ° C contenant le MPO spécifique hydrazide inhibiteur de 4-aminobenzoïque (4-ABH, 10 M). MPO inhibiteurs non spécifiques, tels que l&#39;azoture de sodium (5 mM), peuvent également être utilisés mais ont récemment été suggéré d&#39;exercer des effets non spécifiques supplémentaires à pH 39. </li><li> Monter le plat sur un microscope à fluorescence à grand champ équipé d&#39;un système de chauffage C de 37 ° et un objectif de l&#39;huile 40X. Incuber les cellules sans imagerie pendant 10 minutes pour permettre aux cellules et du matériel à équilibrer. </li><li> Réglez les paramètres de microscope pour acquérir une image de transmission à champ lumineux [phaSE ou contraste d&#39;interférence différentiel (DIC) si disponible] avec 440 nm ou 490 nm excitation et 535 nm émissions toutes les 30 secondes. </li><li> Ajuster le temps d&#39;exposition et la fréquence d&#39;acquisition en fonction du système de microscope pour éviter trop de photoblanchiment et de phototoxicité et en fonction de la question posée expérimentales. Commencez acquisition d&#39;image. </li><li> Après 2 minutes, ajouter 10 x 10 6 (50 pi) zymosan opsonisé FITC vers le centre du plat. Ajuster cible: ratios de cellules en fonction du type de phagocyte et cible utilisée. </li><li> Continuer imagerie pendant 30 min. Après 30 min d&#39;interrompre l&#39;acquisition time-lapse et commencer une minuterie. Déplacez la scène et capturer 10 ou plusieurs instantanés dans différents champs de vision à l&#39;image d&#39;autres phagosomes, tous à moins de 5 min. </li></ol> 3. étalonnage et de contrôle expériences <ol><li> Préparer les solutions d&#39;étalonnage de pH (recettes sont décrites dans le Tableau 1) avant le jour de l&#39;expérience et de geler en portions de 10 ml.Décongeler les solutions d&#39;étalonnage et chaude à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. Vérifier le pH avec un pH-mètre et d&#39;enregistrer le pH réel de solutions. </li><li> Monter une pompe péristaltique sur le plat de fond de verre avant l&#39;acquisition de l&#39;image et effectuer la microscopie de la vidéo en direct, comme décrit ci-dessus (article 2). </li><li> A la fin de la période d&#39;acquisition de 30 min tourner sur la pompe pour éliminer la solution à l&#39;intérieur de la cuvette, ajouter 1 ml de la première solution d&#39;étalonnage et d&#39;arrêter la pompe. </li><li> Attendre que le signal se stabilise, habituellement de 5 min. Répéter l&#39;opération avec chaque solution d&#39;étalonnage. <ol><li> Effectuer au moins une calibration par jour expérimental, et étalonner en commençant par le plus haut et le pH de travail de manière séquentielle à la plus basse, ainsi que le pH de départ et de travail séquentiellement le plus bas vers le plus haut. </li></ol></li><li> A titre de témoin, ajouter 100 ul de 100 uM de l&#39;inhibiteur de la NADPH oxydase diphényl propionium iodure (DPI) dilué dans du HBSS à 900 ul de cellules dans du HBSS dans le fond plat en verre, etincuber pendant 10 min. </li><li> Commencez acquisition et ajouter zymosane comme ci-dessus (étape 2.7). Après 15 min de la phagocytose, ajouter 10 ul de 10 uM de l&#39;inhibiteur V-ATPase concanamycin A (ConcA) dilué dans du HBSS et continuer imagerie pour 15 minutes supplémentaires. </li></ol> 4. Analyse <ol><li> Analyse des films time-lapse et instantanés phagosome. Remarque: Les instructions suivantes sont spécifiques pour ImageJ. Étape par étape les instructions peuvent varier considérablement en fonction du logiciel utilisé, mais les fonctions décrites dans cette section sont disponibles dans la plupart des logiciels professionnels d&#39;analyse d&#39;image. <ol><li> Ouvrez les images avec un logiciel professionnel d&#39;analyse d&#39;image. Soustraire le fond dans le canal 490 en dessinant un petit ROI carré avec l&#39;outil de sélection de polygone carré dans une zone où il n&#39;y a pas de cellules, et en cliquant sur Plugins&gt; BG Soustraction de ROI. Ensuite, téléchargez le même retour sur investissement sur le canal 440 en cliquant sur Modifier&gt; Sélection&gt; Restaurer la sélection et répétez. </li><li>Faire un rapport d&#39;image 32 bits du canal 490 divisé par le canal 440 en cliquant sur Processus&gt; Calculatrice de l&#39;image ..., en sélectionnant les images appropriées dans les menus déroulants ci-Image1 et Image2, puis en sélectionnant &#39;Divide&#39; dans le menu déroulant Opération et la vérification de la case à cocher de résultat de 32 bits (float). </li><li> Modifiez la table de consultation codage couleur à un codage couleur ratio compatible en cliquant sur Image&gt; Tables de recherche&gt; arc RVB. Seuil de l&#39;image de rapport pour éliminer 0 et l&#39;infini pixels en cliquant sur Image&gt; Réglages&gt; Seuil .... Ajustez les barres de défilement pour que zymosane apparaît en rouge et cliquez sur Appliquer, faire que le jeu des pixels de fond à case Nan est sélectionné. </li><li> Combinez ce ratio pile avec le canal champ lumineux en un composite multi-canal en cliquant sur Image&gt; Couleur&gt; Fusionner les couches, et en sélectionnant l&#39;image lumineuse-champ dans le menu gris canal de la liste déroulante et le rapport d&#39;image dans le menu déroulant de la voie verte, et la sélection de laGardez images source case à cocher. Numérisation des films time-lapse ou des instantanés pour déterminer les phagosomes doivent être analysés. Le canal champ lumineux est utile pour cela. </li><li> Dessiner des régions d&#39;intérêt (ROI) en utilisant l&#39;outil de sélection de polygones ovale autour phagosomes, et les ajouter au gestionnaire de ROI en cliquant sur Analyse&gt; Outils&gt; Gestionnaire de ROI&gt; Ajouter. Mesurer leur ratio d&#39;intensité zymosane en cliquant sur Plus&gt; Multi-mesures et de-la sélection de la ligne par un chèque-boîte de tranche. </li><li> Pour les films time-lapse, piste phagosomes un à la fois en dessinant un retour sur investissement, en tapant Ctrl + M pour mesurer chaque point de temps, et en déplaçant le ROI lorsque cela est nécessaire pour suivre les valeurs d&#39;intensité au fil du temps. Copiez les mesures de la fenêtre de résultats dans un tableur. Remarque: L&#39;analyse de 15 (5 cours à temps par expérience x 3) expériences indépendantes est idéal, mais plus ou moins peuvent être nécessaires en fonction de la variabilité observée. Sauvegarde des Rois est toujours recommandé. Certains logiciels permettent REGI d&#39;imagestration et mise à jour dynamique de Rois, faciliter cette partie de l&#39;analyse. </li></ol></li><li> Conversion de fluorescence à des valeurs de pH <ol><li> Mesurer le rapport 490/440 pour phagosomes dans les films time-lapse étalonnage comme décrit dans la section 4.1. </li><li> Dans une feuille de calcul, tracer les valeurs de ratio au fil du temps, et de calculer les valeurs moyennes du ratio de tous les phagosomes dans le champ de vue (généralement, entre 5-20) à partir de 5 points dans le temps dans le milieu de la période de temps correspondant à chaque étalonnage de pH solution. (Voir aussi les boîtes rouges dans la figure 5A.) </li><li> Tracer ces 490/440 valeurs de ratio moyen contre le pH mesurée réelle. Combinez au moins 3 étalonnages indépendants en un seul graphique. Utilisez un logiciel de statistique ou numérique pour effectuer une régression non linéaire (le meilleur de la courbe de forme), généralement à une équation sigmoïde. Note: Par exemple, dans la figure 5B l&#39;équation utilisée était une sigmoïde de Boltzmann [Y = Bottom + ((Haut-Bas)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], où les valeurs y sont les ratios 490/440, X sont les valeurs de pH et haut, en bas, les paramètres V50 et la pente sont calculées par le logiciel. </li><li> Utilisez l&#39;équation obtenue pour transformer les valeurs du rapport au pH. Remarque: Par exemple, sur la figure 5B l&#39;équation obtenue pour la courbe d&#39;étalonnage en présence d&#39;azoture de sodium est 490/440 Ratio = 1,103 + [(2,89 à 1,103) / (1 ​​+ EXP ((6,993 pH) /0.9291)] . La résolution de pH donne l&#39;équation suivante: pH = 6,993 à 0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))]. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomal+proteolysis+in+dendritic+cells+is+modulated+by+NADPH+oxidase+in+a+pH-independent+manner.">Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner.</a> EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).</li><li>Mantegazza, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+controls+phagosomal+pH+and+antigen+cross-presentation+in+human+dendritic+cells.">NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells.</a> Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).</li><li>Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=gamma-Interferon-inducible+lysosomal+thiol+reductase+(GILT)+maintains+phagosomal+proteolysis+in+alternatively+activated+macrophages.">gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages.</a> J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).</li><li>Sanjurjo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scavenger+protein+apoptosis+inhibitor+of+macrophages+(AIM)+potentiates+the+antimicrobial+response+against+Mycobacterium+tuberculosis+by+enhancing+autophagy.">The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy.</a> PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).</li><li>Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utility+of+Chloroquine+in+Cancer+Therapy.">The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy.</a> Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).</li><li>Ohkuma, S., Poole, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+probe+measurement+of+the+intralysosomal+pH+in+living+cells+and+the+perturbation+of+pH+by+various+agents.">Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).</li><li>El Chemaly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSOP/Hv1+proton+channels+sustain+calcium+entry,+neutrophil+migration,+and+superoxide+production+by+limiting+cell+depolarization+and+acidification.">VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification.</a> J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).</li><li>Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HVCN1+channel+conducts+protons+into+the+phagocytic+vacuole+of+neutrophils+to+produce+a+physiologically+alkaline+pH.">The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH.</a> bioRxiv. , (2014).</li><li>Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+regulation+of+the+cellular+responses+to+cold+shock:+the+responses+in+yeast+and+mammalian+systems.">Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems.</a> Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).</li><li>Yui, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basolateral+targeting+and+microtubule-dependent+transcytosis+of+the+aquaporin-2+water+channel.">Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).</li><li>Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+phagosome+individuality+and+membrane+signalling+networks.">On phagosome individuality and membrane signalling networks.</a> Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).</li><li>Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+regulation+of+the+mitochondrial+proton+gradient+during+cytosolic+calcium+elevations.">Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations.</a> J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bien que plus de temps que d&#39;autres méthodes, telles que la spectroscopie et FACS, qui emploient une stratégie similaire en utilisant un colorant sensible au pH couplé à des objectifs, mais mesurer le pH moyen d&#39;une population de phagosomes, microscopie offre plusieurs avantages. La première est que interne et externe lié, mais pas intériorisé, les particules peuvent être aisément distingué sans avoir à ajouter d&#39;autres produits chimiques, comme le bleu trypan ou des anticorps, pour étancher ou ...

Phagocytosis, the process through which innate immune cells engulf large particles, evolved from the eating mechanism of single-celled organisms, and involves binding to a target, enveloping it with a membrane and pinching the membrane off to form a vacuole within the cytosol called a phagosome. While the phagosomal membrane is derived from the plasma membrane, active protein and lipid sorting, as well as fusion with endomembranes during phagosome formation, transform the phagosome into a distinct organelle within the cell with degradative properties that allow the killing, neutralization and breakdown of the ingested material1-3. This process, called phagosomal maturation, relies on the delivery of a host of proteolytic and microbicidal enzymes, including the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase which transfers electrons into phagosomes producing the strong oxidant O2- and its derivative reactive oxygen species (ROS) 2,4. 
The luminal pH of phagosomes has a profound influence on several events required for phagosome function. First, pH influences trafficking of endomembranes in general, as pH-dependent conformational changes of transmembrane trafficking regulators alters the recruitment of trafficking determinants such as Arfs, Rabs and vesicular coat-proteins, which in turn define which vesicles may fuse with phagosomes 5-8. Second, the ionic composition of the phagosomal lumen is also transformed as phagosomes mature, and some ion transporters, such as the Na+/H+ exchanger or ClC family Cl-/H+ antiporters, which promote phagocytic function, rely on H+ translocation 9,10. Similarly, ROS production is intimately linked with phagosomal pH. ROS and its toxic oxidant byproducts have long been recognized as crucial for phagosomal killing in neutrophils 4,11,12, and have been shown to play critical roles in other phagocytes including macrophages, dendritic cells (DCs) and amoeba 13-16. The NADPH oxidase is an electrogenic enzyme that releases H+ in the cytosol as NADPH is consumed, and that requires the simultaneous transfer of H+ through companion HVCN1 channels alongside the transported electrons into the phagosomal lumen, in order to alleviate the massive depolarization that would otherwise lead to self-inhibition of the enzyme 17-21. Finally, several proteolytic enzymes have optimal activity at different pH, so time-dependent phagosomal pH changes can influence which enzymes are active and when. The importance of phagosomal pH is highlighted by organisms such as Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis and Salmonella typherium that subvert phagocytic killing at least in part by altering phagosomal pH 22-24.
In mammals the main phagocytes are neutrophils, macrophages and dendritic cells, and depending on cell type, time-dependent phagosomal pH changes can vary widely, and appear to play different roles. In macrophages a strong and rapid acidification mediated by the ATP-dependent proton pump vacuolar ATPase (V-ATPase) is one of the key factors mediating killing 25-27, resembling the mechanisms present in amoeba that use phagocytosis as an eating mechanism 28. In these cells activation of acidic proteases is thought to play a key role. In contrast, neutrophil killing relies more on ROS as well as HOCl produced by myeloperoxidase (MPO)11, and the pH remains neutral or alkaline during the first 30 min acidifying only later 29,30. Neutral pH has been suggested to favor the activity of oxidative proteases such as certain cathepsins. In DCs phagosomal pH is controversial, with some reporting acidification and others neutral or alkaline pH 31,32, but ROS and pH may profoundly influence the ability of these cells to present antigens to T cells, one of their main functions 33. 
Importantly, hormones, chemokines and cytokines may produce signaling events that induce maturation and changes in phagocyte behavior, and in turn influence phagosomal pH 34,35. Similarly, drugs, for example the antimalarial chloroquine, which is also considered for anti-cancer therapies 36, may affect phagosomal pH and therefore immune outcomes. Thus, a variety of cell biologists, immunologists, microbiologists and drug developers may be interested in measuring phagosomal pH when seeking to understand the mechanisms underlying the effects of a particular genetic disruption, bioactive compound or microorganism on innate and adaptive immune responses. 
Here we describe a method for measuring phagosomal pH in neutrophils that allowed us to show the importance of the HVCN1 channel in regulating neutrophil phagosomal pH 19. The method is based on the ratiometric property of fluorescein isothiocyanate (FITC) whose fluorescence emission at 535 nm is pH sensitive when excited at 490 nm but not 440 nm 37. When this dye is chemically coupled to a target, in this case zymosan, it can be followed using wide-field fluorescence microscopy, where cells are imaged as they phagocytose, and phagosomal pH changes are measured in real time as the phagosome matures. The actual pH is then gleaned by performing a calibration experiment where cells that have phagocytosed are exposed to solutions of different pH that contain the ionophores nigericin and monensin, that allow the rapid equilibration of the pH within phagosomes with the external solution. Ratio values are then compared to the known pH of solutions, a calibration curve is constructed by nonlinear regression and the resulting equation used to calculate pH from the ratio value.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zymosan A powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z4250</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein isothiocyanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F7250</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Z2850</td>
			<td>Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-204107</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diphenyleneiodonium chloride (DPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2926</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanamycin A (ConcA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>27689</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N7143</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monensin</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>ALX-380-026-G001</td>
			<td>Toxic, use gloves, various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14200-075</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s balance salt solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Ringer&#39;s balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate (Na2CO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7795</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3671&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methyl-D-glucamine (NMDG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2004&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3777</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503&#160;</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol (EtOH)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>2860</td>
			<td>Various providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish)</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td>Ibidi &#181;-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath</td>
			<td>O. Kleiner AG</td>
			<td></td>
			<td>A sonicator may be used instead, various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamocytometer</td>
			<td>Marienfeld GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Widefield live imaging microscope</td>
			<td>Carl Zeiss AG</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump (Dynamax RP-1)</td>
			<td>Rainin</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Schott Gerate GmbH</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Counter</td>
			<td>Milian SA</td>
			<td></td>
			<td>Various instrument providers exist</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring phagosome ph by ratiometric fluorescence microscopy

La phagocytose est un processus fondamental par lequel les cellules immunitaires innées engloutissent les bactéries, les cellules apoptotiques ou d&#39;autres particules étrangères dans le but de tuer ou neutraliser la matière ingérée, ou de le présenter comme antigènes et d&#39;initier des réponses immunitaires adaptatives. Le pH de phagosomes est un paramètre critique régulation de fission ou fusion avec endomembranes et l&#39;activation des enzymes protéolytiques, des événements qui permettent à la vacuole phagocytaire à mûrir dans une organelle dégradable. En outre, la translocation des ions H + est requis pour la production de niveaux élevés d&#39;espèces oxygénées réactives (ROS), qui sont essentiels pour la destruction efficace et signalisation à d&#39;autres tissus de l&#39;hôte. De nombreux agents pathogènes intracellulaires subvertissent assassinat phagocytaire en limitant l&#39;acidification du phagosome, soulignant l&#39;importance du pH dans phagosome biologie. Nous décrivons ici une méthode pour mesurer phagosomale quotientométrique pH dans les neutrophiles en utilisant l&#39;isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqué au zymosan que phagocytaire targETS, et imagerie des cellules vivantes. Le dosage est basé sur les propriétés de fluorescence du FITC, qui est refroidi par un pH acide lorsqu&#39;il est excité à 490 nm mais non lorsqu&#39;il est excité à 440 nm, ce qui permet la quantification d&#39;un rapport dépendant du pH, au lieu de fluorescence absolue, d&#39;un seul colorant. Un protocole détaillé pour réaliser in situ colorant étalonnage et la conversion de rapport aux valeurs réelles de pH est également fourni. Simple-dye méthodes ratiométriques sont généralement considérés comme supérieurs à longueur d&#39;onde unique ou protocoles de pseudo-ratiométrique double teinture, car ils sont moins sensibles aux perturbations telles que le blanchiment, les changements de focus, les variations de laser, et l&#39;étiquetage inégale, qui faussent le signal mesuré. Ce procédé peut être facilement modifié pour mesurer le pH dans d&#39;autres types de cellules phagocytaires, et zymosan peut être remplacée par toute autre particule contenant une amine, à partir de billes inertes à des micro-organismes vivants. Enfin, ce procédé peut être adapté pour utiliser d&#39;autres sondes fluorescentes sensibles à des gammes de pH ou d&#39;autres phagosomactivités al, ce qui en fait un protocole généralisé pour l&#39;imagerie fonctionnelle de phagosomes.

Voici les résultats représentatifs pour une expérience où le phagosome pH de neutrophiles de souris primaires isolées de la moelle osseuse de type sauvage ou Hvcn1 - / - les souris ont été comparés. Pour une expérience réussie, il est important d&#39;obtenir suffisamment phagosomes dans le champ de vision pendant toute la durée du film time-lapse, tout en évitant de trop nombreux phagosomes, qui sera ensuite plus difficile de segmenter lors de l&#39;analyse d&#39;image. <strong...

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Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Mesure Phagosome pH par Ratiométrique microscopie à fluorescence

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

measuring-phagosome-ph-by-ratiometric-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K vues.  University of Geneva. Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy. 