Cette méthode traite de la façon d’analyser les processus de développement tels que les contractions musculaires et le roulement qui se produisent dans l’embryon de Drosophile. Certains avantages de cette technique sont qu’elle est non invasive et assez détaillée, mais qu’elle est relativement simple à réaliser. Notre méthode peut être développée davantage pour le dépistage basé sur l’analyse à haute teneur afin d’isoler et d’analyser de nouvelles mutations qui affectent les contractions musculaires embryonnaires et d’autres processus de développement.
Lors de la visualisation des contractions musculaires, il est important de bien temps collections d’embryons parce que les contractions commencent seulement à un stade de développement spécifique. La démonstration visuelle étape par étape peut grandement aider à l’analyse quantitative des processus de développement. Pour l’imagerie en direct des embryons montés de Drosophila, placez les embryons sur le stade d’un microscope d’épifluorescence avec une fonction timelapse et un appareil photo numérique avec des filtres d’émission appropriés et sélectionnez une lentille objective d’immersion d’eau de 10X.
Ensuite, enregistrez en direct les embryons à l’aide du logiciel d’enregistrement au microscope approprié pendant environ une à deux heures avec un taux d’acquisition de quatre images par seconde. À la fin de l’expérience, exportez la vidéo enregistrée directement dans ImageJ. Sélectionnez l’image et la culture pour dessiner une boîte autour de chaque embryon individuel pour recadrer les enregistrements vidéo à la taille de chaque embryon.
Cliquez sur Image, Transformez et tournez pour faire pivoter les images recadrées pour obtenir une position verticale de la ligne médiane de l’embryon par rapport à l’écran. Pour définir les mesures de distance en micromètres, cliquez sur Analyser et définir l’échelle, puis entrez le facteur de conversion du rapport pixel/micron connu pour votre configuration de microscope. Toutes les mesures ultérieures seront ensuite signalées dans les micromètres.
Pour analyser le roulement de l’embryon, marquez d’abord la position d’une ou des deux trachée d’un embryon dans la première image de la vidéo à mi-chemin entre les extrémités postérieure et antérieure et cliquez sur Analyser, outils et gestionnaire de la région d’intérêt. Dessinez environ sept micromètres par sept micromètres autour de la trachée et cliquez sur la touche T sur le clavier pour enregistrer cette position en tant que coordonnée XY. Marquez la position de la même zone de la trachée après des contractions périssaltiques d’intérêt et tracez une ligne reliant les centres de chaque boîte en cliquant sur M sur le clavier pour mesurer la distance entre la position de pré-contraction et la position post-contraction.
Pour analyser les contractions musculaires embryonnaires à l’aide d’embryons exprimant des marqueurs musculaires fluorescents, utilisez l’enregistrement de la lecture fluorescente pour dessiner une région d’intérêt centrée autour des muscles fluorés d’un segment d’intérêt particulier du corps. Sélectionnez l’onglet Ajouter T dans le gestionnaire de la région d’intérêt pour enregistrer le poste de la région d’intérêt. Cliquez sur Région d’intérêt Gestionnaire et Mesure pour enregistrer l’intensité fluorescente moyenne de chaque région d’intérêt sélectionnée pour chaque image de la vidéo.
Déplacez la boîte vers les centres d’autres segments du corps d’intérêt et cliquez sur Ajouter T pour enregistrer leurs positions afin d’obtenir des régions d’intérêt de taille identique dans tous les segments du corps à analyser. Dans la région du gestionnaire d’intérêt, maintenez la clé de contrôle tout en sélectionnant toutes les régions d’intérêt enregistrées sous forme de coordonnées XY. Cliquez sur Plus et Multi-Mesure pour mesurer l’intensité fluorescente moyenne de chaque région d’intérêt pour tous les cadres de la vidéo.
Ceci signalera chaque mesure dans un tableau avec chaque région d’intérêt comme colonne de la table et chaque image comme ligne. Ensuite, transférez la table à un programme de feuille de calcul pour une analyse plus approfondie. Tracez un graphique avec le numéro d’image sur l’axe x et l’intensité moyenne de fluorescence sur l’axe y et convertissez le numéro d’image en temps en utilisant le taux d’image de quatre images par seconde.
Les contractions musculaires augmentent l’intensité du GFP car elles apportent plus de GFP à proximité de la zone focale à mesure que plus de muscles sont attirés par ces contractions. Pour déterminer l’amplitude de contraction musculaire, estimer l’intensité gfp de base comme l’intensité moyenne des régions entre les pics. Évaluez ensuite l’augmentation de l’intensité de fluorescence du GFP par rapport à cette ligne de base.
Divisez ensuite chaque région de valeur d’intensité d’intérêt par l’intensité de base pour normaliser l’intensité du PF GFP jusqu’à la ligne de base. Comparez les intensités normalisées de GFP aux segments postérieur, médial et antérieur pendant l’onde de contraction de muscle pour examiner les changements dans l’ampleur de la contraction de muscle pendant que l’onde se propage et pour déterminer la direction de l’onde. Pour comparer les contractions musculaires sur les côtés gauche et droit de l’embryon, analyser les intensités maximales pour les mêmes segments des deux côtés de l’embryon.
Utilisez l’amplitude de contraction et le moment des pics pour révéler les différences, le cas échéant, et l’étendue et le moment des ondes de contraction musculaire périssaltique. Ici, des contractions musculaires périssaltiques normales dans un embryon sauvage de Drosophila sont montrées. Dans cette vidéo de roulement dans un embryon de type sauvage, notez que l’appendice dorsal ne bouge pas tandis que la trachée indique que l’embryon a roulé dans sa coquille.
Dans cette analyse représentative, les pics de contraction musculaire au cours de la période de 165 à 178 secondes représentent une seule onde vers l’avant. Pour cet embryon, aucune différence dans l’amplitude et le temps des contractions musculaires n’a été mesurée sur les côtés droit et gauche de l’embryon. Une contraction périssaltique est désignée comme onde de type 1 vers l’avant si son profil a un pic qui se pose à la région postérieure d’abord suivi de pics aux régions moyennes et antérieures.
Une onde de type 1 vers l’arrière est un pic qui se pose d’abord à des segments antérieurs, puis se propage vers les régions postérieures. Les ondes de type deux commencent à une extrémité de l’embryon et se dirigent vers les régions moyennes avant de revenir à leur origine sous forme d’onde de balayage redéavenie à l’extrémité opposée. Les embryons mutants de posture de corps démontrent une fréquence relative anormale du type un à la génération d’onde de type deux qui a comme conséquence une anomalie de posture de corps désignée comme phénotype de torsion ou de rotation de corps.
Pour utiliser la fluorescence comme une lecture pour les paramètres de contraction musculaire, il est essentiel d’utiliser des embryons avec un journaliste dans le tissu musculaire. Cette méthode peut être utilisée pour l’enregistrement simultané des contractions musculaires de nombreux embryons et pour l’évaluation des réponses à divers stimuli, médicaments ou changements environnementaux.
