Les auteurs remercient NSF (MCB-1157876) pour le financement. Nous remercions également Alberto Civetta, John Roote, et deux arbitres anonymes pour leurs commentaires.

Expériences à petite échelle doivent être effectuées afin de se familiariser avec la procédure. 1. Collecte femelles vierges et les mâles Naïve La version la plus simple de l&#39;expérience décrite se compose de quatre types de croisements initiaux, qui impliquent la combinaison suivante des adultes: A) W individus 1118 afin de recueillir des femelles vierges, b) Oregon-R individus afin de recueillir les mâles de référence naïfs, c ) P {sw} mâles homozygotes et les femelles vierges à partir d&#39;une ligne de commande qui porte l&#39;organisation de type sauvage de Sdic afin de recueillir les mâles expérimentaux naïfs (type I) et d) P {sw} Les mâles homozygotes et Sdic-sw-suppression porteurs femelles vierges afin de recueillir les mâles expérimentaux naïfs qui portent le déficit Sdic-sw (Type II). <ol><li> Mettre en place plusieurs flacons contenant 8-10 femelles et 5 mâles chacun. Laisser les femelles pondentœufs et de transférer les adultes à de nouveaux flacons tous les 3-5 jours. Utilisez des bouteilles plutôt que des flacons si nécessaire et utilisez toujours des aliments frais. Le nombre de flacons requis dépendra du nombre de types d&#39;expérimentation, l&#39;étude et le nombre d&#39;individus estimés nécessaires pour détecter des différences (tableau 1). Plus de 10 femmes par flacon pourraient aboutir à la surpopulation cours de la croissance larvaire, ce qui peut entraîner une variation de la fertilité de la descendance. Conserver les flacons à 25 ° C dans une chambre à température contrôlée. </li><li> Commencez à collecter des femelles vierges et les hommes naïfs, les jours 11 et 12 ème après la mise en place des croix initiales. Le délai d&#39;attente varie selon la température; inférieure températures résultat dans le temps de développement plus retarder la collection d&#39;individus. Un autre facteur affectant le calendrier de l&#39;éclosion est le type de milieu. Aliments nutritifs, tel que le milieu de semoule de maïs levure 29, assure le bon développement de l&#39;adultele système reproducteur, ce qui facilite l&#39;accouplement. Recueillir désaccouplé vole tous les 4-6 heures. Lors de la collecte, anesthésier les mouches en introduisant CO 2 dans le flacon, appuyez sur les mouches vers le bas, et le sexe les sous loupe binoculaire (Figure 2). Placez les mouches souhaités dans différentes fioles selon le sexe et le phénotype et l&#39;étiquette des flacons de façon appropriée. </li></ol> Note 1. routine de collecte commence le matin en écartant les adultes qui ont émergé au cours de la nuit précédente. Recueillir femelles vierges et les hommes naïfs une ou deux fois pendant la journée. Typiquement, D. melanogaster mâles deviennent sexuellement matures 8 h après l&#39;éclosion à 25 ° C 30. Si les mouches sont maintenus sous lumière / obscurité cycles h 12:12, deux pics d&#39;éclosion sont attendus: au cours de l&#39;1-2 premières heures après le feu est allumé, et au cours de la 2 h avant que le feu est éteint. Eclosion se produit dans les 24 heures après le s&#39;assombrit chrysalide. Note 2. Pas plus de 10 femelles should être mis dans le même flacon pour éviter la surpopulation. Cela limite également la perte de femelles dans le cas où ils doivent être jetés parce qu&#39;au moins l&#39;un d&#39;eux n&#39;est pas vierge. Note 3. Afin de recueillir le nombre approprié de femelles vierges et les hommes naïfs dans un court laps de temps, les mesures suivantes peuvent être adoptées. Mettre en place des flacons de 15-20 w 1118 pour des expériences impliquant deux types de mâles expérimentaux (tableau 1). Saupoudrer la surface des médias et ajouter quelques granules de levure active séchées pour faciliter la ponte. Transfert des parents au moins 4 fois sur plusieurs jours consécutifs. Pour augmenter la surface disponible pour la nymphose dans chaque flacon, insérer du papier multi-plié (7 x 5 cm) au cours de la 4 e ou 5 e jour après que les parents sont transférés dans un autre flacon (Figure 3). Si le nombre d&#39;adultes issus de la croix initiale ne suffit pas, attendre quelques jours de plus et de recueillir des individussal de flacons mis en place à des dates différentes. Prévoyez de réaliser les expériences sur plusieurs jours consécutifs pour égaliser la charge de travail. 2. Expériences Double-accouplement La figure 4 montre les principales étapes impliquées dans des expériences double accouplement effectuées dans 14. <ol><li> Le matin du Jour 1, mis en place le premier accouplement. Les mâles Oregon-R sont les premiers à s&#39;accoupler dans l&#39;essai d&#39;infraction. <ol><li> L&#39;utilisation de l&#39;aspirateur, mettre en place des flacons contenant 4 au 5 octobre, un jour w femelles vierges 1118 aux yeux blancs et 10 mâles naïfs Oregon-R aux yeux rouges chacun. Deux à trois flacons sont mis en place tous les jours pendant 5 jours consécutifs. Le nombre de flacons à mettre en place peut varier en fonction du nombre de personnes disponibles. Laisser les mouches s&#39;accouplent pendant 2 heures. </li><li> Jeter Oregon-R mâles et placer chaque femelle dans un nouveau flacon à l&#39;aide d&#39;un aspirateur (figure 5). identification du sexe peut être réalisé par une inspection visuelle de quelquesdifférences morphologiques (Figure 2). Étiqueter chaque flacon de façon appropriée et laisser la femelle dans la fiole pendant 2 jours (ci-après &quot;v1&quot;). </li></ol></li><li> Au jour 3, mis en place le deuxième accouplement. Sélection d&#39;hommes et de cross mis en place devrait être effectuée au hasard afin de minimiser tout risque de biais vers l&#39;un des types masculins expérimentaux. <ol><li> Deux heures avant que le feu est éteint, transférer à nouveau la femelle dans un nouveau flacon avec un aspirateur. Étiqueter le nouveau flacon de façon appropriée (ci-après &quot;v2&quot;). </li><li> Présentez trois 5-6-jour vieux mâles expérimentaux du même génotype en v2. </li><li> Répéter 2.2.1 et 2.2.2 pour chaque femelle. </li><li> Le jour 4, deux heures juste avant la lumière est allumée (pas plus de 12 heures après la 2.2.1), jeter les mâles à l&#39;aide de l&#39;aspirateur. </li></ol></li><li> Au jour 6, transférer chaque femelle à nouveau dans un autre nouveau flacon. Etiqueter les nouveaux flacons de manière appropriée (ci-après «v3»). </li><li> Le jour 10, jeter le 1118 w </sup&gt; femelles. </li><li> Examiner les descendances en v2 et v3. La première inspection est effectuée après 13-15 jours après que la femelle est introduit dans v2 (ou v3), par exemple le jour 17 après la première ponte a commencé féminin dans v2. La deuxième inspection est effectuée exactement au bout de 17 jours. Ce délai constitue une limite temporelle supérieure de sécurité qui garantit l&#39;absence de deuxième génération dans le même flacon. Deux inspections prévenir la surpopulation, tout en facilitant le comptage des descendants. <ol><li> Le jour 17, inspecter v1 et s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y progéniture yeux rouges présents, sinon marquer le flacon en conséquence. Présence de descendants aux yeux blancs indique que la femelle n&#39;était pas vierge au moment de l&#39;accouplement initial alors qu&#39;aucune descendance indique que l&#39;accouplement avec la référence ou les mâles expérimentaux n&#39;ont pas eu lieu. </li><li> Le jour 17, effectuer la première inspection de la v2. Anesthetize émergé progéniture en v2 avec le CO 2 et les trier par couleur des yeux et le sexe. numéros de descendance record engendrés par le premier et sechommes ond. Figure 6 montre les phénotypes attendus dans la descendance de chaque système d&#39;accouplement. Dans cette expérience, notamment 14, seule la descendance femelle peut être affecté sans ambiguïté comme engendré par la référence ou les mâles expérimentaux et donc que l&#39;information de filles peut être utilisé pour calculer P 2. Si d&#39;autres marqueurs de la paternité de la progéniture mâle peut être affecté sans ambiguïté, le nombre de descendants des deux sexes peuvent être utilisés dans les calculs en aval. Jeter la descendance, mais garder v2 pour la deuxième inspection. </li><li> Au jour 20, procédez comme en 2.5.2 avec la progéniture nouvellement apparues dans v2, puis jetez le flacon. </li><li> Au jour 20, inspecter la descendance émergé en v3 pour la première fois et suivez l&#39;étape 2.5.2. </li><li> Le jour 23, procédez comme en 2.5.3 avec la progéniture nouvellement apparues dans la version 3. </li></ol></li></ol> Note 1: En raison de l&#39;effet gonflant potentiel sur P scores que l&#39;accouplement multiple pourrait avoir (2.2.2 et 2.2.3), l&#39;accouplementpeut être limitée à un laps de temps particulier. Le délai dépendra de la fréquence remating associée avec le génotype des femelles et des mâles utilisés. La probabilité d&#39;accouplement multiple est spécialement réduite pendant la nuit 11. Note 2: Ne pas ajouter de pellets de levure vivantes, car cela pourrait causer des problèmes dus à la prolifération potentielle de la levure lorsque le nombre de mouches adultes est faible. 3. Analyse des données <ol><li> Compte de la descendance enregistrés devraient être organisées de manière appropriée pour une inspection visuelle facile et analyse efficace avec un progiciel statistique approprié (par exemple JMP de SAS Institute) ou des outils Web gratuits (par exemple <a href="http://www.vassarstats.net/" target="_blank">http://vassarstats.net/</a> ). </li><li> Capacité concurrentielle sperme. Ajouter chefs de v2 et v3. Les mouches femelles qui ont donné lieu à aucune ou très peu de descendants (par exemple &lt;10), décédée au cours de la procédure, ou ont seulement réussi à l&#39;inséminationted par l&#39;un des deux hommes sont considérés comme non-informatif et sont exclus de toute analyse statistique aval (2.5.1 et tableau 2). Calculer la note 2 P pour chaque femelle informative. </li><li> Vérifier s&#39;il existe des différences statistiquement significatives dans les valeurs P 2 entre les hommes expérimentaux comparés. Cela peut être fait en utilisant paramétrique (HSD de Tukey par exemple) ou des tests non paramétriques (par exemple acier Dwass) en fonction de plusieurs facteurs, notamment l&#39;asymétrie de la distribution des valeurs P 2 et la dépendance entre la variance et la moyenne. La transformation angulaire est couramment appliquée dans des proportions telles que P 2 avant l&#39;utilisation de tests paramétriques 31. </li><li> différences de taux de connexion (en option). Pour chaque type masculin expérimental, calculer le nombre de femelles fécondées doublement et ceux qui ne accouplé avec le premier homme (le mâle de référence dans l&#39;essai d&#39;infraction et le mâle expérimental dans le ddosage de efense). L&#39;utilisation d&#39;un test exact bilatéral de Fisher (disponible à <a href="http://www.langsrud.com/fisher.htm" target="_blank">http://www.langsrud.com/fisher.htm</a> ), déterminer s&#39;il existe des différences statistiquement significatives entre les deux types de mâles expérimentaux. </li><li> Le sex-ratio (en option). Pour chaque mâle expérimental, à utiliser le test du chi-carré pour déterminer si le sex-ratio dans la descendance de chaque femelle s&#39;écarte du rapport 1:1 attendu. </li></ol>

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	<li>Darwin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The descent of man and selection in relation to sex. , (1871).</li><li>Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+and+its+evolutionary+consequences+in+the+insects.">Sperm competition and its evolutionary consequences in the insects.</a> Biol. Rev. 45, 525-567 (1970).</li><li>Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , (1998).</li><li>Jones, B., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bayesian+sperm+competition+estimates.">Bayesian sperm competition estimates.</a> Genetics. 163, 1193-1199 (2003).</li><li>Griffiths, R. C., McKechnie, S. W., McKenzie, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+and+sperm+displacement+in+natural+populations+of+Drosophila+melanogaster.">Multiple mating and sperm displacement in natural populations of Drosophila melanogaster.</a> Theor. Appl. Genet. 62, 89-96 (1982).</li><li>Jonsson, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+transfer,+storage,+displacement,+and+utilization+in+Drosophila+melanogaster.">Sperm transfer, storage, displacement, and utilization in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 47, 1719-1736 (1962).</li><li>Boorman, E., Parker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+(ejaculate)+competition+in+Drosophila+melanogaster,+and+the+reproductive+value+of+females+to+males+in+relation+to+female+age+and+mating+status.">Sperm (ejaculate) competition in Drosophila melanogaster, and the reproductive value of females to males in relation to female age and mating status.</a> Ecol. Entomol. 1, 145-155 (1976).</li><li>Gromko, M. H., Gilbert, D. G., Richmond, R. C., Smith, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm Competition and the Evolution of Animal Mating Systems. , 372-427 (1984).</li><li>Clark, A. G., Aguade, M., Prout, T., Harshman, L. G., Langley, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+sperm+displacement+and+its+association+with+accessory+gland+protein+loci+in+Drosophila+melanogaster.">Variation in sperm displacement and its association with accessory gland protein loci in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 139, 189-201 (1995).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J., Prout, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+x+male+interactions+in+Drosophila+sperm+competition.">Female x male interactions in Drosophila sperm competition.</a> Science. 283, 217-220 (1999).</li><li>Civetta, A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+effects+on+male+and+female+components+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Chromosomal effects on male and female components of sperm precedence in Drosophila.</a> Genet. Res. 75, 143-151 (2000).</li><li>Greenspan, L., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Associations+between+variation+in+X+chromosome+male+reproductive+genes+and+sperm+competitive+ability+in+Drosophila+melanogaster.">Associations between variation in X chromosome male reproductive genes and sperm competitive ability in Drosophila melanogaster.</a> Int. J. Evol. Biol. 2011, 214280 (2011).</li><li>Chapman, T., Neubaum, D. M., Wolfner, M. F., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+male+accessory+gland+protein+Acp36DE+in+sperm+competition+in+Drosophila+melanogaster.">The role of male accessory gland protein Acp36DE in sperm competition in Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 267, 1097-1105 (2000).</li><li>Yeh, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+evidence+that+a+recently+evolved+Drosophila+sperm-specific+gene+boosts+sperm+competition.">Functional evidence that a recently evolved Drosophila sperm-specific gene boosts sperm competition.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 2043-2048 (2012).</li><li>Pitnick, S., Markow, T. A., Spicer, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+multiple+kinds+of+female+sperm-storage+organs+in+Drosophila.">Evolution of multiple kinds of female sperm-storage organs in Drosophila.</a> Evolution. 53, 1804-1822 (1999).</li><li>Pitnick, S., Miller, G. T., Schneider, K., Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ejaculate-female+coevolution+in+Drosophila+mojavensis.">Ejaculate-female coevolution in Drosophila mojavensis.</a> Proc. Biol. Sci. 270, 1507-1512 (2003).</li><li>Nonidez, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+phenomenon+of+reproduction+in+Drosophila.">The internal phenomenon of reproduction in Drosophila.</a> Biol. Bull. 39, 207-230 (1920).</li><li>Miller, G. T., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-female+coevolution+in+Drosophila.">Sperm-female coevolution in Drosophila.</a> Science. 298, 1230-1233 (2002).</li><li>Manier, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+mechanisms+of+competitive+fertilization+success+in+Drosophila+melanogaster.">Resolving mechanisms of competitive fertilization success in Drosophila melanogaster.</a> Science. 328, 354-357 (2010).</li><li>Simmons, L., Siva-Jothy, M., Birkhead, T. R., M&#248;ller, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm competition and sexual selection. , 826 (1998).</li><li>Singh, S. R., Singh, B. N., Hoenigsberg, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+remating,+sperm+competition+and+sexual+selection+in+Drosophila.">Female remating, sperm competition and sexual selection in Drosophila.</a> Genetics and Molecular Research. 1, 178-215 (2002).</li><li>Markow, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+investigation+of+the+mating+system+of+Drosophila+hydei.">A comparative investigation of the mating system of Drosophila hydei.</a> Animal Behaviour. 33, 775-781 (1985).</li><li>Barbadilla, A., Quezada-D&#237;az, J. E., Ruiz, A., Santos, M., Fontdevila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolutionary+history+of+Drosophila+buzzatii.+XVII.+Double+mating+and+sperm+predominance.">The evolutionary history of Drosophila buzzatii. XVII. Double mating and sperm predominance.</a> Genet. Sel. Evol. 23, 133-140 (1991).</li><li>Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+sperm+competition+and+sperm+storage+in+Drosophila.">Direct visualization of sperm competition and sperm storage in Drosophila.</a> Curr. Biol. 9, 841-844 (1999).</li><li>Turner, M. E., Anderson, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+predominance+among+Drosophila+pseudoobscura+karyotypes.">Sperm predominance among Drosophila pseudoobscura karyotypes.</a> Evolution. 38, 983-995 (1984).</li><li>Harshman, L. G., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inference+of+sperm+competition+from+broods+of+field-caught+Drosophila.">Inference of sperm competition from broods of field-caught Drosophila.</a> Evolution. , 1334-1341 (1998).</li><li>Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlotterer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+mating+in+wild+Drosophila+melanogaster+revisited+by+microsatellite+analysis.">Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis.</a> Mol. Ecol. 7, 915-917 (1998).</li><li>Price, C. S., Dyer, K. A., Coyne, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition+between+Drosophila+males+involves+both+displacement+and+incapacitation.">Sperm competition between Drosophila males involves both displacement and incapacitation.</a> Nature. 400, 449-452 (1999).</li><li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: A Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fly+Pushing:+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics.">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics.</a> , (1997).</li><li>Sokal, R. R., Rohlf, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biometry : the principles and practice of statistics in biological research. , (1994).</li><li>Clark, A. G., Begun, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+genotypes+affect+sperm+displacement+in+Drosophila.">Female genotypes affect sperm displacement in Drosophila.</a> Genetics. 149, 1487-1493 (1998).</li><li>Clark, A. G., Dermitzakis, E. T., Civetta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nontransitivity+of+sperm+precedence+in+Drosophila.">Nontransitivity of sperm precedence in Drosophila.</a> Evolution. 54, 1030-1035 (2000).</li><li>Wigby, S., Chapman, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+competition.">Sperm competition.</a> Curr. Biol. 14, 100-102 (2004).</li><li>Pizzari, T., Parker, G. A., Birkhead, T. R., Hosken, D. J., Pitnick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sperm biology: an evolutionary perspective. , 674 (2008).</li><li>Ram, K. R., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminar+influences:+Drosophila+Acps+and+the+molecular+interplay+between+males+and+females+during+reproduction.">Seminar influences: Drosophila Acps and the molecular interplay between males and females during reproduction.</a> Integr. Comp. Biol. 47, 427-445 (2007).</li><li>Civetta, A., Rosing, K. R., Fisher, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+sperm+competition+and+sperm+competition+avoidance+in+Drosophila+melanogaster.">Differences in sperm competition and sperm competition avoidance in Drosophila melanogaster.</a> Animal Behaviour. 75, 1739-1746 (2008).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons décrit le protocole expérimental pour évaluer les différences dans la contribution relative des organismes génétiquement distincte D. melanogaster mâles à la descendance dans des expériences contrôlées en double accouplement 7,8. Cela a été fait dans le cadre d&#39;un facteur génétique hypothèse d&#39;influer sur la capacité concurrentielle sperme et il a été illustré dans le dosage de l&#39;infraction même si une procédure similaire s&#39;applique à l&#39;analyse de...

Depuis Geoff Parker a noté la prévalence de la compétition spermatique chez les insectes et ses implications évolutives 2, une vague d&#39;études chez la drosophile et d&#39;autres espèces ont tenté de faire la lumière sur ce phénomène à différents niveaux. Quelques exemples de domaines d&#39;intérêt ont fait l&#39;étude de sa variation dans les populations naturelles 9,10, son architecture génétique et la pertinence des facteurs sous-jacents génétiques 11-14, et son rôle dans la coévolution entre les sexes 15,16 conduite. Dans D. melanogaster femelles, la capacité limitée des organes de sperme stockage spécialisés, une paire de spermathèque et le réceptacle séminal 6,17, contribue à la compétition du sperme de mâles différents. Environ 1.500 spermatozoïdes sont transférés pendant l&#39;accouplement pour la femelle, mais seulement ~ 500 peuvent être logés dans les organes mentionnés 18,19. Dans le laboratoire, contrôlée en double accouplement expériencements impliquant un mâle de référence et un ou plusieurs mâles d&#39;intérêt ont été largement utilisés pour évaluer la capacité concurrentielle sperme 7,8. Capacité concurrentielle sperme est estimée comme étant la proportion de la progéniture désirée par le mâle expérimental dans des expériences double accouplement sur ​​la descendance totale, c&#39;est à dire à la fois le dispositif expérimental et les mâles de référence. Compétitivité sperme comprend deux composants, chacun d&#39;entre eux évaluée dans un essai séparé. Dans le dosage d&#39;infraction, la capacité du sperme mâle expérimental pour déplacer le sperme du premier mâle, soit le mâle de référence, est évaluée. Inversement, dans le dosage de la défense, la capacité du sperme mâle expérimental pour résister à un déplacement ou à réduire le taux de fécondation des spermatozoïdes de sexe masculin de référence est évalué. Selon le type de dosage, de la défense ou de délit, la capacité concurrentielle de sperme est estimé par les scores P 1 ou P 2, respectivement. P1 et P 2 ne peut prendre des valeurs entre 0 et 1. Les valeurs intermédiaires sont habituellement interprétées comme une preuve indirecte de sperme de mélange, ce qui suggère un scénario physiologique impliquant la compétition spermatique direct. Suivant le même raisonnement, les valeurs extrêmes peuvent être interprétées comme une preuve d&#39;une forte capacité compétitive de sperme de différentiel. Les premières études ont montré que P 2 D. melanogaster est plus de 0,8 augmente à mesure que le temps écoulé entre les deux accouplements allonge 7. Ce même protocole expérimental a été utilisé dans d&#39;autres espèces de drosophiles, P 2 étant la statistique communément utilisée dans les études pour évaluer sperme capacité concurrentielle 20. Pour la plupart des espèces, les 2 valeurs P des souches testées est supérieur à 0,6 21. Néanmoins, plusieurs autres mécanismes non liés à la concurrence directe entre le sperme des mâles différents peuvent donner des scores identiques (voir la discussion). Dprogéniture istinguishing engendré par la première ou la deuxième mâles est possible grâce à l&#39;utilisation de marqueurs facilement identifiables. Dans les premières études, l&#39;un des hommes a été irradiées à des doses sublétales de, par exemple, les rayons X de telle sorte que pratiquement tous les ovules fécondés par le sperme irradié n&#39;ont pas réussi à éclore 7. Par la suite, mutations altérant la pigmentation des yeux ou de la forme de l&#39;aile ont été les marqueurs les plus couramment utilisés. Des exemples du premier sont les mutations pc (brun) 9, cn (cinabre) et 22 W (blanc) 23, tandis que les mutations CY (Curly) 24 correspond au deuxième type de phénotypes; certaines de ces mutations ont été combinés dans le même individu, par exemple cn pc. Dans une moindre mesure, allozymes 25 et microsatellites avec 26,27 modes de transmission connus ont également été utilisés. Le dispositif expérimental pour tester les différences danscapacité concurrentielle sperme décrit ici suit essentiellement celle de Clark et al. 9. Résultats tirés de ces expériences donnent des informations uniquement sur la paternité différentielle des types masculins expérimentaux sous la loupe. Les analyses qui font également compte des différences post-fécondation in aptitude 14,28 et techniques de visualisation sperme 24 permettent des différences de 1 P (ou P 2) marque à être interprétées comme des différences dans les compétences de sperme. La figure 1 présente la justification de l&#39;infraction et les analyses de défense. Pour illustrer la logistique du processus, une expérience d&#39;infraction réalisée en D. melanogaster 14 sera expliquée en détail. Ce test d&#39;infraction particulière a été utilisée pour tester un effet mesurable de la famille chaîne intermédiaire dynein spécifique des spermatozoïdes multigénique (Sdic) sur la capacité concurrentielle sperme. Tous les membress de cette famille multigénique résident en tandem sur le chromosome X. mâles Knockout ont été générés par la suppression de la grappe Sdic. Parce que le segment supprimé comprenait également l&#39;aile courte du gène essentiel (SW) et le but de l&#39;étude était d&#39;évaluer la pertinence de Sdic, les hommes portant la délétion Sdic-sw ont été secourus par une copie transgénique sw (symbolisé par P {sw} , qui a également réalisé un gène rapporteur mini-white) sur le chromosome 2. La couleur des yeux a été utilisée comme un marqueur visible pour l&#39;identification de paternité. Tous les mouches étaient dans un fond blanc mutant à l&#39;exception de ceux de la souche Oregon-R, qui ont été utilisés comme hommes de référence.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Amber latex tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62996-473</td>
			<td>1/4 inch ID, 1/6 inch Wall</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>1 ml graduated XL filter tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1126-7810</td>
			<td>Any 1 ml pipette tip can be used but semi-transparent and long tips are better as a fly receiver. If filter tips are used, poke out and discard the filter using a needle after the tip end is trimmed</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-7793</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Mesh Fabric</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Thin and smooth</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S6D</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>CO2 Tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD-50</td>
			<td>Use FlyNap (Carolina Biological Supply Company) as an alternative if CO2 is not available</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>FlyStuff Foot Valve, complete system</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121C</td>
			<td>Not necessary if FlyNap is used</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Plastic vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Come with carboard trays that can be reused for holding vials</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Cotton balls</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AS-212</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Active dry yeast</td>
			<td>Red Star</td>
			<td></td>
			<td>Found in general grocery store</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sharpie markers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Different colors may be used for marking different genotypes</td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

assessing differences in sperm competitive ability in drosophila

La concurrence entre les mâles conspécifiques pour féconder l&#39;ovule est l&#39;un des mécanismes de la sélection sexuelle, à savoir la sélection qui fonctionne sur la maximisation du nombre d&#39;événements d&#39;accouplement réussi plutôt que sur la survie et la viabilité maximisation 1. Compétition spermatique représente la compétition entre les mâles après accouplement avec la même femelle 2, dans lequel leur sperme sont une coïncidence dans le temps et l&#39;espace. Ce phénomène a été rapporté dans plusieurs espèces de plantes et d&#39;animaux 3. Par exemple, sauvage capturé D. melanogaster femelles contiennent généralement des spermatozoïdes 2-3 mâles 4. Les spermatozoïdes sont stockés dans des organes spécialisés ayant une capacité de stockage limitée, ce qui pourrait mener à la concurrence directe du sperme de différents hommes 2,5. En comparant sperme compétitivité des mâles différents types d&#39;intérêts (mâles expérimentaux) a été réalisée à travers contrôlée expérimentale double accouplementts dans le laboratoire 6,7. En bref, une seule femelle est exposé à deux mâles différents consécutivement, un mâle expérimental et un mâle de référence croisée accouplement. Le même schéma d&#39;accouplement est suivie par d&#39;autres types d&#39;expérimentation, facilitant ainsi la comparaison indirecte de la capacité concurrentielle de leur sperme à travers une référence commune. La fraction d&#39;individus engendrés par les expériences et les mâles référence est identifié en utilisant des marqueurs, qui permet d&#39;estimer la capacité concurrentielle du sperme en utilisant des expressions mathématiques simples 7,8. En outre, la capacité concurrentielle sperme peut être estimée à deux scénarios différents selon que le mâle expérimentale est la deuxième ou la première à s&#39;accoupler (infraction et le dosage de la défense, respectivement) 9, qui est supposé être le reflet de différents attributs de compétences. Nous décrivons ici une approche qui permet d&#39;interroger le rôle des différents facteurs génétiques qui sous-tendent putativement tIl phénomène de la capacité concurrentielle sperme dans D. melanogaster.

Le tableau 2 résume quelques traits saillants de deux expériences d&#39;infractions (essais 1 et 2) dans laquelle D. melanogaster mâles expérimentaux avec et sans (Type I et II, respectivement) un cluster Sdic fonctionnel sont comparées 14. Après prise en compte des incidences différentes rencontrées avec certaines répliques, 58-83% des femelles ont été trouvés à être informatif et donc les comptes de la paternité de leur progéniture pourraient être utilisé...

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Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

Différentiel capacité concurrentielle des spermatozoïdes chez les<em&gt; Drosophila</em&gt; Mâles avec des génotypes distincts peuvent être vérifiées par des expériences double contact. Chacune de ces expériences implique l&#39;un des hommes d&#39;intérêts et un mâle de référence. Marqueurs facilement identifiables dans la descendance permettent d&#39;inférence de la fraction d&#39;individus engendrés par chaque mâle.

Différences Évaluation de la capacité concurrentielle de sperme dans<em&gt; Drosophila</em

Competition among conspecific males for fertilizing the ova is one of the mechanisms of sexual selection, i.e. selection that operates on maximizing the ...

assessing-differences-in-sperm-competitive-ability-in-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Assessing Differences in Sperm Competitive Ability in Drosophila

14.5K vues.  University of California, Irvine. Différentiel capacité concurrentielle des spermatozoïdes chez les Drosophila Mâles avec des génotypes distincts peuvent être vérifiées par des expériences double contact. Chacune de ces expériences implique l'un des hommes d'intérêts et un mâle de référence. Marqueurs facilement identifiables dans la descendance permettent d'inférence de la fraction d'individus engendrés par chaque mâle.

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Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Recherche

Biologie

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Techniques d&#39;imagerie Ca 2 + Signalisation dans le sperme humain

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

L&#39;isolement et la In vitro Activation des Caenorhabditis elegans Sperme

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Changement de forme d&#39;imagerie cellulaire en vie Drosophile Embryons

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualisation et suivi des ARNm endogènes dans Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Moyen-throughput Screening tests pour l’évaluation des effets sur Ca2 +-signalisation et Acrosome Reaction en sperme humain

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Évaluation de la capacité phagocytique spécifique à l’âge des hémocytes adultes de Drosophila melanogaster à l’aide d’un test de phagocytose in vivo

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent adult integument. Their immobility and transparency make them ideal for in vivo live imaging experiments. Many studies have focused on the dorsal epithelial monolayer of the pupal&#160;notum because of its accessibility and relatively large size. In addition to the studies of epithelial mechanics and development, the notum has been an ideal tissue to study wound healing. After an injury, the entire epithelial repair process can be captured by live imaging over 6-12 h. Despite the popularity of the notum for live imaging, very few published studies have utilized fixed notum samples. Fixation and staining are common approaches for nearly all other Drosophila tissues, taking advantage of the large repertoire of simple cellular stains and antibodies. However, the pupal notum is fragile and prone to curling and distortion after removal from the body, making it challenging to complement live imaging. This protocol offers a straightforward method for fixing and staining the pupal notum, both intact and after laser-wounding. With this technique, the ventral side of the pupa is glued down to a coverslip to immobilize the pupa, and the notum is carefully removed, fixed, and stained. The notum epithelium is mounted on a slide or between two coverslips to facilitate imaging from the tissue&#39;s dorsal or ventral side.

Dissecting, Fixing, and Visualizing the Drosophila Pupal Notum

The present protocol details the preparation and visualization of fixed tissue of the Drosophila pupal notum. It can be used for either intact or wounded tissue, and the original architecture of the tissue is preserved. The procedures for dissecting, fixing, and staining are all described in this article.

Disséquer, fixer et visualiser la nymphe de la drosophile Notum

The pupae of Drosophila melanogaster are immobile for several days during metamorphosis, during which they develop a new body with a thin transparent ...