Les techniques zymographiques actuelles détectent un nombre limité de protéases. La zymographie fluorescente de peptide emploie des peptides fluorescents comme substrat dégradable permettant la mesure d’une plus grande gamme de protéases. Le principal avantage de cette méthode est sa conception modulaire.
La séquence du peptide fluorescent détermine quelles protéases sont détectées et le peptide fluorescent peut facilement être échangé avec un peptide d’une séquence différente, une capacité à détecter d’autres protéases. Cette technique peut aider à éclairer la conception de peptides’use en tant que relieurs dégradables dans les biomatériaux conçus tels que ceux utilisés pour l’administration de médicaments ou des applications d’ingénierie tissulaire. L’incorporation de ce peptide dans cette technique peut identifier les protéases sécrétées par les tissus qui sont responsables de la dégradation des biomatériaux.
La démonstration de cette technique est importante afin de visualiser l’approche multicque unique par rapport à d’autres techniques de zymographie. La démonstration de cette technique sera, Ameya Deshmukh, un étudiant diplômé de mon laboratoire. Pour commencer, préparez une solution de gel de résolution de 10% polyacrylamide telle que décrite dans le tableau un du protocole de texte.
Immédiatement avant de verser le gel, ajouter le TEMED et l’APS. Ensuite, remplissez et videz la cassette de gel mini de 1,5 millimètre à mi-chemin avec la solution de gel de résolution. Ajouter une fine couche d’isopropanol au sommet du gel de polyacrylamide pour produire un gel de niveau et prévenir les bulles.
Utilisez la solution de polyacrylamide reste pour suivre la progression de la réaction de polymérisation. Lorsque le polyacrylamide dans le tube a complètement solidifié la réaction est complète. Alors que la première couche de gel de résolution est polymérisante, récupérer le kit Azido-PEG3-Maleimide de stockage à 20 degrés Celsius et permettre aux composants d’atteindre la température ambiante.
Ensuite, dissoudre les composants de flacon deux dans le fabricant recommandé volume de DMSO. Et vortex pendant 30 secondes pour s’assurer que les liquides sont bien mélangés. Transférer le contenu du flacon un dans un flacon de fond rond propre et sec de 100 millileter qui contient une barre d’agitation.
Insérez immédiatement un bouchon septum en caoutchouc avec un diaphragme qui peut être perforé avec une seringue dans la bouche du flacon. Ensuite, insérez deux aiguilles de seringue de calibre 18 dans le diaphragme. Connectez l’une des aiguilles de seringue à un réservoir d’essence inerte et laissez le gaz remplir le flacon du fond rond pendant trois minutes.
Ensuite, coupez le gaz inerte et détachez-le de l’aiguille. À l’aide d’une seringue, injecter le contenu complet du flacon deux dans le flacon. Retirer les deux aiguilles et la seringue.
Laisser mélanger les composants pendant 30 minutes à température ambiante en remuant. Après cela, retirez le bouchon de septum en caoutchouc et transférez le contenu dans un tube de centrifugeuse propre de cinq millilitres. Une fois que la première couche de gel de résolution a polymérisé verser la couche isopropanol.
Pipet un millilitre d’eau déionisée sur le dessus du gel, puis versez l’eau pour rincer le gel. Récupérez le peptide fluorescent fonctionnalisé au thiol de stockage à 80 degrés Celsius. Laissez-le décongeler à température ambiante.
Préparez une solution gel 10% résolvant contenant la molécule de liaison Azido-PEG3-Maleimide et le peptide fluorescent tel que décrit dans le tableau un du protocole de texte. Immédiatement avant de verser le gel ajouter le TMED et APS. Ensuite, remplissez la moitié de la partie restante de la cassette de gel avec la solution de gel de résolution peptidique.
Ajouter une fine couche d’isopropanol au sommet du gel de polyacrylamide pour produire un gel de niveau et prévenir les bulles. Utilisez la solution de polyacrylamide reste pour suivre la progression de la réaction de polymérisation. Une fois la réaction terminée, verser la couche isopropanol.
Pipet un millilitre d’eau déionisée sur le dessus du gel, puis versez l’eau pour rincer le gel. Si vous n’utilisez pas les gels immédiatement, conservez-les en les immergeant dans une boîte en plastique remplie de 100 millilitres de 1x PBS à quatre degrés Celsius. Envelopper la boîte dans du papier d’aluminium pour éviter le photobleaching.
Tout d’abord, préparez une solution de gel empilage de 5 % telle qu’elle est décrite dans le tableau un du protocole texte. Immédiatement avant de verser le gel ajouter le TMED et APS. Remplissez le reste de la partie vide de la cassette de gel avec la solution de gel empilage.
Insérez rapidement un peigne gel de 1,5 millimètre dans la couche de gel empilant en vous assurant qu’aucune bulle ne reste emprisonnée sous les puits. Utilisez la solution de polyacrylamide reste pour suivre la progression de la réaction de polymérisation. Lorsque la réaction est terminée, retirez doucement le peigne et la bande de l’arrière de la cassette de gel.
Pour commencer, dissoudre les échantillons dans le tampon d’échantillon de zymographie conventionnelle. Ajouter 400 millilitres os 1X tris glycène SDS tampon en cours d’exécution à l’appareil de gel. Chargez jusqu’à 35 microlitres d’échantillon par puits.
Exécutez les échantillons à 120 volts à quatre degrés Celsius pendant une heure et demie ou jusqu’à ce que les normes de poids moléculaire indiquent que les protéases d’intérêt se trouvent dans la couche de gel résolvant le peptide. Après cela, retirer les gels de la cassette en plastique. Lavez les gels trois fois dans un tampon de re-naturing à température ambiante sous l’agitation douce.
À chaque lavage, d’une durée de 10 minutes. Transférer les gels dans une solution tampon en développement pendant 15 minutes. Remplacez ensuite la solution par un tampon frais en développement et incubez à 37 degrés Celsius sous une douce agitation pendant 24 heures.
Après cela, utilisez un imageur de scanner de gel fluorescent avec les filtres d’excitation et d’émission appropriés pour l’image des gels. Dans cette étude aux peptides dégradables fluorescents de protéase sont incorporés dans les gels de polyacrylamide. QGIW est une séquence dérivée de collagène conçue pour détecter la collagène cellulaire, tandis que LACW est une séquence qui a été optimisée pour la détection de MMP-14 et MMP-11.
L’imagerie fluorescente révèle de nombreuses bandes dans les gels peptidiques LACW, alors qu’une seule bande est observée dans les gels QGIW. Comparés à la zymographie de gélatine, les gels de LACW sont capables de détecter plus de bandes protéolytiques, ce qui démontre la capacité de la zymographie peptidique à détecter un plus large éventail de protéases présentes dans les échantillons biologiques que les méthodes traditionnelles utilisant des substrats indigènes. Les cellules de zymographie peptidique sont ensuite incubées dans un tampon de développement contenant soit GM6001, un inhibiteur du MMP à large spectre, soit E64, un inhibiteur général de la cathepsine.
Le traitement des gels peptidiques LACW avec GM6001, diminue l’intensité des bandes. Alors que le traitement par E64 n’a aucun effet discernable. Le traitement des gels peptidiques QGIQ avec GM6001 entraîne une ablation complète des bandes précédemment observées.
Alors que e64 n’a aucun effet. La zymographie à la gélatine est effectuée à l’aide de MMP-9 purifié et activé pour comparer la sensibilité de la zymographie peptidique à l’étalon-or actuel. Les gels LACW sont capables de détecter les plus petites concentrations de MMP-9.
Les protéases nécessitent des conditions spécifiques pour redesserner et s’activer. Préparez soigneusement les solutions tampons pour vous assurer que la composition et le PH sont corrects. Cette méthode peut être complétée par des techniques existantes pour vérifier l’identité et effectuer une analyse plus approfondie des protéases mesurées.
Cela inclut le ballonnement occidental, le PCR en temps réel et la spectrométrie de masse. Soyez prudent lors de la manipulation du polyacrylamide. La solution non variable est considérée comme une neurotoxine puissante et l’équipement de protection individuelle approprié doit toujours être porté lors de sa manipulation.
