Nous avons décrit une procédure pour détecter et quantifier l’acide iophenoxic dans le sérum de mangouste. Les résultats suggèrent que l’acide iophénoxique peut être utilisé comme marqueur biologique pour vérifier l’absorption bêta chez l’espèce. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle permet la quantification des analogues de l’acide iophénoxique à des parties par milliard de niveaux, en utilisant une technique simple de précipitation protéique.
Pour la phase A mobile, combiner un millilitre d’acide formique avec un litre d’eau ultra pure. Pour la phase B mobile, combiner un millilitre d’acide formique avec un litre d’acétylonitrile. Pour le diluant, mélanger un millilitre d’acide trifluoroacétique avec 200 millilitres d’acétyltrile.
Ensuite, pesez environ 10 milligrammes de méthyle-IPA sur le microbalance, et enregistrez la masse à plus ou moins 0001 milligrammes. Transférer quantitativement le méthyle-IPA dans un flacon volumétrique de classe A de 10 millilitres, à l’aide de quatre à cinq millilitres d’acétyltrile. Sonicate pendant une minute pour dissoudre tous les solides, puis mettre en volume avec de l’acétyltrile.
Transférer environ huit millilitres de chaque bouillon sur des flacons de verre ambré de huit millilitres avec des bouchons doublés ptfe et conserver les échantillons à température ambiante. Ensuite, transférez le stock restant aux déchets dangereux. Pour le stock 25X sept stocks de méthyle-IPA préparer un stock de méthyl-IPA et d’acétyltrile à environ 200 microgrammes par millilitre.
Transférer un millilitre du stock dans un flacon de cinq millilitres et diluer en volume avec de l’acétyltrile. Ensuite, transférez le bouillon dans un flacon de verre ambré de huit millilitres avec un bouchon doublé PTFE et rangez-le à température ambiante. À l’aide d’un pipettor à répétition, préparez les six stocks supplémentaires de méthyle-IPA de 25 X décrits dans le protocole texte en flacons de verre ambré de huit millilitres avec bouchons doublés ptfe et rangez-les à température ambiante.
Pour le stock de substitution 25X, transférer 0,1 millilitre du stock concentré d’éthyl-IPA à un flacon volumétrique de classe A de 10 millilitres à l’aide d’une seringue en verre de 100 microlitres, puis diluer en volume avec de l’acétylisation. Transférer environ huit millilitres du stock de substitution dans un flacon de verre ambré de huit millilitres avec bouchon doublé PTFE et les conserver à température ambiante. Transférer le reste du stock vers des déchets dangereux.
Ensuite, préparez des stocks 4X contenant à la fois du méthyle-IPA et de l’éthyl-IPA dans des flacons d’échantillonneurs de verre en verre de 10 millilitres, tel que décrit dans le protocole de texte. Par exemple, pour préparer le stock 4X7, ajouter 0,2 millilitres du stock 25X sept stock méthylique-IPA à un flacon de deux millilitres à l’aide du pipettor de répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre. Ajouter 0,2 millilitres du stock d’éthyl-IPA de substitution 25X à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre.
Ajouter 0,85 millilitres d’acétylonitrile à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité d’un millilitre. Capuchon le flacon solidement et inverser cinq fois pour mélanger. Par la suite, préparez la courbe standard en flacons d’échantillonneurs automatiques à vis de deux millilitres tels que décrits dans le protocole texte.
Par exemple, pour préparer la norme sept, ajouter 0,2 millilitres du stock 4X7 à un flacon de deux millilitres, à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre. Ajouter 0,6 millilitres d’eau ionisée ultra pureté à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité d’un millilitre. Capuchon les flacons solidement et inverser cinq fois pour mélanger.
Pour chaque échantillon, préparer un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre contenant de 200 à 300 milligrammes de chlorure de sodium et disposer les tubes dans une grille en plastique à 80 position. Pour chaque échantillon, étiquetez un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre comme tube de centrifugeuse A et un deuxième tube de micro centrifugeuse comme B.Arrangez les tubes dans une grille en plastique de 80 position. Placez les matériaux et l’équipement suivants nécessaires à l’extraction du sérum dans une armoire de biosécurité de classe deux : les tubes de micro centrifugeuse, un mélangeur vortex, un pipettor à répétition avec des pointes de capacité de 0,5 millilitre et de cinq millilitres, une pipette de déplacement d’air de 100 à 1000 microlitres avec des pointes de 1000 microlitres, des contenants avec environ 100 millilitres chacun d’eau ionisée diluante et ultra pureté, et un récipient à déchets biodangereux.
Ensuite, retirez les échantillons de sérum de l’entreposage congelé et réchauffez-les à température ambiante dans l’armoire de biosécurité. Vortex mélanger chaque échantillon de sérum avant l’échantillonnage. À l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre, distribuez 05 millilitres de sérum mangouste dans le tube A et ajoutez 05 millilitres du stock de substitution 25X.
Ajouter ensuite 0,95 millilitres de diluant au tube A à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de cinq millilitres. Capuchon des tubes solidement et mélange vortex pendant 10 à 15 secondes. Ensuite, ajoutez le sérum mongoose de commande au tube A.Fortify chacun des échantillons de 4QC avec me-IPA utilisant un pipettor de répétition avec une pointe de capacité de 0,5 millilitre.
Ajouter 25X stock de substitution aux échantillons qc. Ensuite, ajouter le diluant aux échantillons qc. Capuchon des tubes et mélange vortex.
Distribuez le chlorure de sodium pré-pesé dans le tube A et le mélange de vortex trois fois pendant huit à 12 secondes. Puis, essuyez les surfaces extérieures de la grille de flacon contenant le tube A à l’aide de 70% d’isopropanol. Après avoir retiré les échantillons de l’armoire de biosécurité, le tube de centrifugeuse A à 1200 fois G pendant une minute pour séparer les phases aqueuse et acétytrile.
Pipette 0,8 millilitres de la phase supérieure de l’acétylonitrile au tube B, à l’aide d’une pipette de déplacement d’air de 100 à 1000 microlitres. Transférer le reste de la solution dans le tube A aux déchets dangereux et jeter le tube vide dans un contenant de déchets biodangereux. Maintenant, retirez l’acétylonitrile et le trifluoroacétique du tube B avec un léger flux de gaz azoté dans un bain d’eau de 45 degrés Celsius.
Ajouter 0,25 millilitres d’acétylonitrile au tube B à l’aide d’un mélange de pipettor et de vortex répété pendant quatre à cinq secondes. Puis, centrifugeuse à 1200 fois G pendant deux à quatre secondes pour recueillir le liquide dans le fond du tube. Après centrifugation, ajouter 0,75 millilitres d’eau déionisée ultra pure au tube B à l’aide d’un pipettor à répétition avec une pointe de capacité de cinq millilitres et un mélange de vortex pendant quatre à cinq secondes.
Centrifugeuse à 1200 fois G pendant une minute pour clarifier l’échantillon. Ensuite, transférez 0,75 millilitres du supernatant sur un flacon d’échantillonneur automatique à l’aide d’une pipette de déplacement d’air de 1 000 microlitres et jetez les pointes de pipette dans le contenant de déchets biorisques. Plafonnez chaque flacon d’échantillonneur automatique en toute sécurité pour l’analyse LC-MS/MS.
Transférer le reste de la solution dans le tube B vers les déchets dangereux et jeter le tube vide dans un contenant de déchets biodangereux. Configurer le LC-MS/MS avec tous les paramètres décrits dans le protocole texte. Puissance sur le LC-MS/MS et permettre à la colonne d’atteindre 70 degrés Celsius avant de fixer la vitesse d’écoulement à 0,8 millilitres par minute.
Configurer une séquence dans le logiciel d’acquisition de données pour injecter la courbe standard avant et après chaque lot composé d’échantillons de contrôle de la qualité et d’échantillons inconnus. Injectez toutes les normes et échantillons et acquérez des chromatogrammes d’ion MR à l’aide des paramètres énumérés dans le protocole texte. Après l’achèvement de la séquence, éteignez le LC-MS/MS et éliminez tous les flacons d’échantillonneur automatique dans les déchets dangereux.
Le chromatogramme iion du sérum mongoose de contrôle illustre le temps de rétention de l’éthyl-IPA et l’absence de méthyl-IPA au moment de rétention indiqué. Le chromatogramme iion de l’échantillon de contrôle de la qualité illustre la séparation de base du méthyle-IPA de l’éthyl-IPA, ainsi que les transitions quantificatives et qualificatives pour le méthyle-IPA. Le chromatogramme iion de l’échantillon représentatif de l’étude montre une concentration observée de sérum de 33,5 microgrammes par microlitre de méthyle-IPA.
La précision et les résultats de précision pour le sérum mongoose de contrôle enrichi de méthyle-IPA sont montrés ici. Les recouvrements pour cent allaient de 96,9 à 109 %, l’écart relatif en pourcentage aux trois niveaux d’enrichissement était de 3,4 % respectivement de 1,7 % et de 2,3 %. La précision et les résultats de précision pour le sérum mongoose de contrôle enrichi d’éthyl-IPA sont montrés ici.
Les recouvrements pour cent allaient de 89,5 à 115 %L’écart type relatif en pourcentage aux cinq niveaux d’enrichissement était de 4,3 %, 1,5 %, 2,3 %, 5,6 % et 1,1 % respectivement. Toutes les mangoustes offraient des appâts éthyliques-IPA et méthylique-IPA consommaient au moins 25 % de l’appât dans les 24 heures et avaient des niveaux quantifiables d’éthyl-IPA et de méthyl-IPA dans leur sera, respectivement. L’utilité potentielle de la méthode pourrait être accrue en configurant le LC-MS pour recueillir des données pour d’autres analogues de l’acide iophénoxique, tels que le propyl et l’acide iophénoxique butyle.
Nous avons encouragé le personnel à consulter les recommandations les plus récentes du comité consultatif sur les pratiques d’immunisation ou de son comité de biosécurité institutionnelle pour obtenir des conseils sur la nécessité d’une vaccination contre la rage avant l’exposition. Les articles 2.3 à 2.6 de ce protocole impliquant le travail avec le sérum non dilué devraient être exécutés dans un coffret de biosécurité de classe deux.
