La microscopie d’éclairage structuré à super résolution, 3D-SIM, est une technique novatrice pour la visualisation des protéines fluorescentes des récepteurs de germination dans les membranes des spores. À l’aide de ces procédures, une résolution inégalée de la localisation des germinosomes et des domaines lipidiques de la membrane interne des spores peut être obtenue. La technique sera démontrée par juan Wen, doctorant, et Raymond Pasman, étudiant à la maîtrise en sciences, de notre laboratoire.

Avant de commencer l’intervention, nettoyez les couvre-chefs de haute précision avec de l’acide chlorhydrique d’une molaire pendant 30 minutes dans un bain d’eau qui tremble doucement, suivi de deux lavages de cinq minutes dans de l’eau ultrapure de type 1. Après le deuxième lavage, placez les coverslips dans 100% éthanol pendant environ trois minutes avant de sécher les coverslips et de vérifier leur clarté. Ensuite, le microscope en verre propre glisse avec 70% d’éthanol pendant une minute avant de permettre aux glissières de sécher et de vérifier leur clarté.

Pour l’imagerie par microsphère fluorescente et spores, d’abord préchauffer deux diapositives sur un bloc chauffant de 70 degrés Celsius pendant quelques secondes avant d’ajouter une gouttelette de 70 degrés Celsius et de 65 microlitres de 2 % stérilisée sur l’une des diapositives. Placez l’autre glissière sur le dessus pour étendre l’agarose entre les glissières. Après cinq minutes, retirer l’une des glissières et couper l’agarose séchée en une section d’un centimètre par un.

Ajouter une fois 10 aux huitièmes microsphères fluorescents ou spores dans 0,4 microlitres d’eau stérile et ultrapure de type 1 à l’agarose, et placer un coverslip de haute précision sur le patch à l’aide du coverslip pour glisser le patch hors de la diapositive sur la surface du coverslip. Ensuite, fixez un cadre gene de 65 microlitres de 1,5 par 1,6 centimètre sur une glissière séchée et placez le coverslip sur le cadre, fermant tous les coins du cadre. Pour l’imagerie des échantillons, placez la diapositive sur un microscope à éclairage structuré équipé d’un objectif d’huile 100X et concentrez-vous sur les microsphériques fluorescents de 100 nanomètres.

Ajustez l’anneau de correction sur l’objectif 100x jusqu’à ce qu’une fonction de propagation de point symétrique soit obtenue pour minimiser le flou des images, et sélectionnez un champ de vision avec environ 10 microsphères fluorescents ronds. Appliquez un réglage de mise au point de grille pour les longueurs d’onde d’excitation désignées, dans ce cas, 561 et 488 nanomètres, comme guide pour le logiciel d’analyse d’image avant de se concentrer sur les spores avec la lumière de transmission. Capturez une image de lumière de transmission dans le mode 16x moyen avec des expositions de 20 millisecondes pour chaque image.

Ensuite, capturez des images fluorescentes brutes au microscope à éclairage structuré en 3D des spores avec le mode d’éclairage 3D-SIM. Pour la reconstruction des tranches, cliquez sur Param sur la feuille d’onglets de la garniture d’éclairage structurée pour ouvrir la fenêtre de reconstruction des tranches N-SIM. Suivez les instructions suggérées, et cliquez sur les contrôles appropriés pour définir le contraste de modulation d’éclairage à l’auto, la suppression du bruit haute résolution à un, et la suppression floue hors de la mise au point à 0,05 comme points de départ.

Ensuite, cliquez sur Reconstruire Slice pour reconstruire l’image et évaluer la qualité des images reconstruites par les images rapides transformées par Fourier et le score de reconstruction qui sont affichés après la reconstruction. Réglez le bruit haute résolution de 0,1 à cinq et la suppression floue hors de la mise au point de 0,01 à 0,5 jusqu’à ce que les meilleurs paramètres soient obtenus. Ensuite, cliquez sur Appliquer pour appliquer les modifications.

Cliquez près pour fermer la fenêtre. Ouvrez une image brute tachée de SPORES PS4150 FM4-64. Ensuite, cliquez sur Reconstruire Slice pour exécuter la reconstruction de la tranche, et enregistrer l’image reconstruite.

Pour convertir les images brutes 3D-SIM du geminosome KGB80 en images pseudo-widefield, cliquez à gauche sur le plugin ImageJ SIMcheck et sélectionnez Raw Data SI et Pseudo Widefield. Sélectionnez au hasard environ 25 spores dans chaque image de transmission inversée pour une analyse germinosome ultérieure dans les images fluorescentes pseudo-widefield jusqu’à ce qu’environ 350 spores aient été sélectionnées. Ensuite, utilisez ImageJ pour évaluer l’intensité maximale de chaque signal fluorescent exprimé par chaque groupe de spores et l’intensité intégrée de chaque image de spore 3D.

Pour analyser les images pseudo-widefield du germinosome KGB80, utilisez la valeur moyenne d’intensité intégrée de sept piles comme intensité de signal intégrée de la spores du KGB80. Ensuite, déterminez les intensités de fond en imagerie de la souche de fond PS4150 à l’aide de paramètres identiques, et considérez les taches fluorescentes dans les spores individuelles du KGB80 comme des foyers germinants lorsqu’elles sont clairement distinguables de l’arrière-plan. Dans cette expérience représentative, deux foyers des spores fluorées GerD-GFP sont apparus dans différentes piles avec trois foyers GerD-GFP totaux observés dans la pile z3 compositive.

Ici, une spore avec un seul point focal GerD-GFP dans la spore a été observée. Au total, environ 40 à 50 % des spores avaient respectivement deux ou un groupe GerD-GFP et GerKB-mCherry. Alors que l’intensité intégrée de la protéine d’échafaudage GerD-GFP était différente d’une population à l’autre, l’intensité intégrée de GerKB-mCherry était à peu près la même dans différentes populations.

Lorsque la spore avait plusieurs foyers, l’intensité maximale de fluorescence des foyers GerD-GFP et GerKB-mCherry tendait à diminuer, et la fluorescence maximale de tous les points lumineux, considérés comme les foyers germinants, était plus élevée que l’auto fluorescence maximale des spores ps4150. Notamment, des taches FM4-64 plus brillantes semblables à des foyers germinants apparaissent dans les spores intactes et décodées de PS4150, ce qui suggère que ces taches FM4-64 plus brillantes pourraient être impliquées dans le regroupement des protéines germinales dans la membrane interne. L’ajout de spores à l’agarose et le placement de l’agarose dans le cadre nécessite un mouvement fluide continu et prudent pour ces minis matériaux.

La conversion d’images brutes 3D-SIM du germinosome KGB80 en images pseudo-widefield et leur interprétation nécessite des connaissances spécialisées sur la biologie des spores. Notre procédure structurée de microscopie d’illumination peut être appliquée à l’imagerie des protéines basses abondantes ou des journalistes de fluorescence faible dans différentes bactéries ou d’autres matériaux de bande. L’organisation du germinosome peut maintenant être étudiée à l’aide de procédures d’étiquetage double pour évaluer la co-localisation des protéines de germination bacillus et des domaines membranaires spécifiques.