Les implants cartilagineux représentent une méthode translationnelle facilement accessible pour interroger le remodelage des tissus dans la matrice du cartilage. La méthode peut fournir un aperçu précoce de la façon dont les nouveaux traitements potentiels affectent la structure articulaires. Le principal avantage de cette technique est que ce cartilage reste dans un environnement 3D natif, qui permettent le profilage de l’interaction entre les cellules et la matrice environnante à l’aide de biomarqueurs.
Le principe de la méthode n’est pas propre au cartilage. Les explantations peuvent être extraites d’autres tissus tels qu’un ovium, un foie et un poumon et interrogées à l’aide de biomarqueurs dérivés de la matrice. Amalie Engstrom, étudiante diplômée de notre laboratoire, démontrera la procédure.
Effectuez l’ensemble du processus d’approvisionnement en tissus à l’extérieur d’une hotte d’écoulement laminaire dans un environnement aseptique. À partir d’un abattoir local, obtenir une articulation du genou fémoral tibial tibial bovine entière auprès de veaux âgés de 1,5 à 2 ans. Puis, disséquez doucement le genou du mollet en enlevant d’abord l’excès de chair, en découvrant les condyles, le ménisque, les tendons et la membrane synoviale.
Couper les tendons et la membrane synoviale permettant à l’articulation de démembrer. Retirer le ménisque pour exposer les condyles fémoraux. Utilisez un poinçonneur de biopsie de trois millimètres pour isoler les explants de la zone de charge des condyles fémoraux et les libérer de la surface auriculaire en coupant avec un scalpel parallèle et aussi près que possible de l’os subchondral.
Conservez et mélangez immédiatement les explants dans le milieu de culture du glutimax DMEM F12 contenant 1 % de pénicilline et de streptomycine dans un tube de 50 millilitres ou une boîte de Pétri. Pour commencer la culture tissulaire, transférez les explants à une plaque stérile de puits 96 dans une hotte d’écoulement laminaire plaçant toutes les répliques dans chaque groupe en diagonale pour minimiser la variation induite par l’évaporation. Ajouter pbs aux puits extérieurs de la plaque de culture pour éviter davantage l’évaporation du surnatant.
Ensuite, lavez les explantations trois fois dans le milieu de culture ou PBS. Culture des explantations dans 200 microlitres de milieu de culture par puits jusqu’au début de l’expérience jusqu’à 10 semaines dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Si vous appliquez des traitements, préparez-les à la concentration souhaitée dans les puits d’explantation par dilution dans le milieu de culture avant de changer le milieu.
Changez le milieu de culture tous les deux à trois jours dans une hotte d’écoulement laminaire. Retirez délicatement le supernatant de chaque puits et transférez-le dans une nouvelle plaque de puits 96 pour le rangement. Ajoutez immédiatement 200 microlitres de culture fraîche moyenne ou de traitement à chaque puits.
Ne laissez pas sécher les explants pendant le changement moyen et assurez-vous que toutes les explants sont complètement immergées dans le nouveau milieu. Sceller la nouvelle plaque avec du ruban adhésif et la conserver à moins 20 degrés Celsius pour l’analyse des biomarqueurs du renouvellement des tissus et de l’expression des protéines. Pour commencer un test de résazurine, faire une solution de milieu de culture contenant 10% de resazurine.
Récoltez le supernatant tel que décrit précédemment et plongez les explants dans la solution de 10% de resazurine à 37 degrés Celsius pendant trois heures ou jusqu’à ce que les supernatants deviennent violets. Ensuite, transférez la solution de resazurine conditionnée et de contrôle de fond à une plaque de microtiter noire et mesurez la fluorescence à une excitation de 540 nanomètres et une émission de 590 nanomètres. Après cela, submerger les explants dans le milieu de lavage pendant cinq à 10 minutes pour permettre à la résazurine de se diffuser complètement et d’ajouter un nouveau milieu de culture ou des traitements s’ils sont utilisés.
Continuer à mesurer l’activité métabolique une fois par semaine comme mesure indirecte de la viabilité cellulaire. Dans cette étude, les explants bovins à pleine profondeur sont isolés, cultivés et traités. Les explants sont divisés en quatre groupes pour le traitement, y compris ceux traités avec l’Oncostatin M et le facteur alpha de nécrose de tumeur, ceux traités avec l’Oncostatin M et le facteur alpha de nécrose de tumeur avec GM 6001, ceux traités avec le facteur un de croissance d’insuline, et un contrôle sans traitement.
L’activité métabolique est relativement stable tout au long des trois semaines pour les quatre groupes. Il y avait une tendance pour iGF-1 à augmenter et O plus T groupes à diminuer par rapport au contrôle. O plus T est ensuite appliqué aux puits de culture trois fois par semaine pour étudier o plus T dégradation du cartilage médiatisé.
O plus T est vu pour augmenter la dégradation de collagène de type deux du septième au 21ème jour et la dégradation aggrecane des jours trois à 14 comparés au groupe témoin. L’ajout de GM 6001 en combinaison avec O plus T bloque la sortie de l’O plus T 2M médiatisé, mais n’a qu’un impact limité sur AGN X1 avec des niveaux similaires au groupe O plus T au jour 10. L’insuline comme facteur de croissance un est appliquée trois fois par semaine aux explants bovins pleine profondeur pour étudier comment les modules anabolisants de stimulation le chiffre d’affaires d’ECM de cartilage.
L’effet de l’IGF-1 sur les explants de cartilage a été principalement observé sur des mesures de la formation de collagène de type deux comme prévu pour des stimulus anabolisants. En traitant avec IGF-1, les niveaux pro-C2 diminuent moins que ceux observés dans le groupe témoin, indiquant que l’IGF-1 stimule la formation de collagène de type deux dès le septième jour. Les explantations peuvent se détériorer au fil du temps et il est donc essentiel de faire attention au pipetage dans toutes les étapes de traitement et de lavage afin de ne pas perdre ou détruire les explants dans les différentes étapes d’échange de médias.
Les résultats générés à l’aide de ce modèle ne devraient pas être autonomes, mais être étayés par des données générées dans les tissus humains ainsi que cellulaires et dans de nouveaux modèles pour valider davantage les résultats. Pour faire la lumière sur le mécanisme sous-jacent dans le tissu et pas seulement les résultats, il est possible d’analyser davantage les tissus et les supernatants en utilisant d’autres techniques de biologie moléculaire, telles que l’analyse de l’expression des gènes et des protéines, ou l’immunohistochimie, ou d’autres techniques permanentes de biologie moléculaire.
