Ce protocole permet un examen in vitro en profondeur du microenvironnement ovarien. Permettre aux utilisateurs de déterminer la croissance et le développement des follicules, ainsi que la stéroïdogenèse et l’abondance des molécules immunitaires. L’un des avantages de cette technique est la capacité d’évaluer directement les changements dans le micro-environnement ovarien et les follicules émergents et d’évaluer l’interaction unique causée par l’ajout d’hormones spécifiques.
Cette technique peut être utilisée pour étudier une variété de troubles de la reproduction provoquant des arrêts folliculaires. Par exemple, le syndrome des ovaires polykystiques. Puisque nous pouvons évaluer directement le microenvironnement ovarien in vitro, la démonstration de la procédure sera brooke Bell, une chercheuse de premier cycle de mon laboratoire.
À l’aide de pinces à mâchoires cérérées, fixez l’ovaire, coupez en deux et commencez à enlever les tranches extérieures. S’assurer qu’aucune profondeur de surface supérieure à un à deux millimètres est coupée de l’ovaire afin qu’aucune médulla ne soit collectée. Coupez trois à quatre fines bandes du cortex ovarien avec un scalpel et placez les bandelettes dans la troisième boîte de Petri remplie de PBS.
Coupez les bandes en petits morceaux carrés de 0,5 à un millimètre cube avec une lame de scalpel. Utilisez une règle sous les boîtes de Petri pour vous assurer que les pièces sont de taille et d’épaisseur similaires afin de créer des pièces de cortex ovarien cohérentes. Lavez les morceaux corticaux ovariens dans les trois boîtes de Petri PBS et à champ antibiotique, en utilisant des pinces à pointe incurvée pour déplacer les pièces entre les lavages.
Déplacez les morceaux de cortex à travers la série de lavages LB-15 et placez-les dans une boîte de Petri finale remplie de LB-15. Étiquetez le couvercle avec l’ID de l’animal et le côté ovarien. Collectez quatre morceaux de cortex ovarien par ovaire et fixez-les pour l’histologie du jour zéro et congelez des morceaux supplémentaires pour la purification de l’ARN.
Utilisez les morceaux de tissu restants pour la culture. Préparez une armoire de sécurité biologique pour un lavage final des tissus et une préparation de culture. Désinfectez les fournitures avec de l’éthanol à 70 % avant de les placer dans l’armoire de sécurité biologique.
Déplacez tous les morceaux de cortex ovarien destinés à la culture dans l’armoire de sécurité biologique et lavez-les une fois de plus dans une boîte de Petri remplie de LB-15. Pipette 350 microlitres de milieu Waymouth par puits dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Placez des inserts de puits de culture non revêtus dans chaque puits à l’aide de pinces en vous assurant qu’aucune bulle ne se forme sous la base de l’insert.
Positionnez soigneusement et délicatement quatre morceaux de cortex ovarien sur le maillage de chaque insert sans perforer le maillage. Incuber le tissu à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Changer le milieu de culture du cortex ovarien tous les jours pendant sept jours en s’assurant d’utiliser un milieu Waymouth préchauffé.
Pendant les changements de milieu, utilisez des pinces pour soulever doucement l’insert hors du puits et recueillir le milieu Waymouth cultivé dans des tubes de 0,5 millilitre. Replacez l’insert dans le puits et ajoutez 350 microlitres de milieu de culture frais en le distribuant entre le côté de l’insert et le puits. Conservez le milieu recueilli à partir de la culture tissulaire à moins 20 degrés Celsius.
Après sept jours de culture, imagez les morceaux du cortex ovarien à l’aide d’un microscope à dissection avec une caméra connectée et un logiciel d’imagerie informatique. Fixer deux morceaux de cortex ovarien par puits dans la solution de Bouin pour l’histologie et congeler instantanément des morceaux de cortex ovarien dans de l’azote liquide pour obtenir de l’ARN pour l’ADNc. Répétez cette étape pour tous les puits avec du tissu, puis prélevez le milieu à partir du septième jour et stockez-le moins 20 degrés.
Laissez les morceaux de cortex ovarien rester immergés dans la solution de Bouin pendant environ 1,5 heure, puis lavez-les trois fois avec de l’éthanol à 70%, conservez le tissu dans de l’éthanol à 70% et éliminez-le quotidiennement jusqu’à ce que la solution ne soit plus jaune. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a été réalisée pour les follicules primordiaux, les follicules primaires précoces, le follicule primaire, le follicule secondaire et le follicule antral. La stadification folliculaire a été réalisée sur un cortex ovarien fixé avant et après la culture pour évaluer la folliculogenèse.
La différence de morphologie déterminée par le dépôt de collagène peut indiquer une fibrose dans le cortex ovarien à partir d’une marche d’escalier ou de génisses de contrôle. Une comparaison de la surface moyenne de coloration positive rouge picrosirius par cortex ovarien rempli entre les génisses témoins et les génisses d’escalier est montrée ici. La collecte quotidienne du milieu de culture a été regroupée sur trois jours pour évaluer la production variée d’hormones stéroïdes, à l’aide d’un essai radioimmunologique.
Les métabolites stéroïdiens et la production de cytokines ont également été mesurés dans un milieu de culture du cortex ovarien à partir d’un puits pour chaque animal mis en commun sur quatre jours de culture. Plus le tissu reste longtemps, plus il peut être difficile de travailler avec. Vous devrez peut-être pratiquer des coupes précises.
Cette technique est utilisée pour comprendre les effets sur les voies de transduction du signal pour sauver l’excès de stéroïdogenèse afin de déterminer les effets de l’excès de stéroïdes sur la production de cytokines et de chimiokines, et pour déterminer les effets sur la progression ou l’arrêt des follicules dans le tissu ovarien.
