Nous remercions les professeurs, des boursiers, des résidents et des adjoints au médecin de l&#39;hôpital Brigham and Women, le Département de pathologie pour rendre les tissus disponibles pour ces études. Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de l&#39;Institut de NIH / National du Cancer (P50 CA105009, CA108748 K08, U01 CA152990), Fonds de recherche en cancer ovarien, La Fondation Mai Kay, Novartis Pharma, Robert et Deborah Premier Fonds, Randi et le cancer ovarien Joel Cutler Fonds de recherche, Marsha Rivkin Fondation - Scholar Award scientifique, l&#39;AACR - George et Patricia Sehl de bourses pour la recherche en génétique du cancer, et la bourse médecin américain de médecine en Israël - Claire et Emmanuel G. Rosenblatt subvention de la Fondation.

1. Préparation de collagène et de revêtement du filtre. <ol><li> Pour préparer humaine collagène placentaire, tweeze à 30 mg de collagène placentaire humaine et de mettre sur le dessus de 50 ml d&#39;eau distillée (dH 2 O) dans un bécher de 500 ml avec un barreau d&#39;agitation. </li><li> Ajouter 100 μls d&#39;acide acétique glacial directement sur le collagène pour le rendre plus facile à dissoudre. Chaude à 37 ° C et remuer pour dissoudre le collagène. Il devrait se dissoudre dans les 20-30 minutes. Si brins de collagène restent en solution, la stérilisation du filtre sera difficile. </li><li> Diluer le stock de 50 ml avec 450 ml de dH 2 O et filtre stériliser avec une membrane de 0,2 um. C&#39;est la solution de travail final. Conserver à 4 ° C. </li><li> Préparer membranes Transwell filtre en les enduisant de collagène (50-100 ul) pendant la nuit. Collagène réfrigérée doit être réchauffé à la température ambiante et ensuite ajouté à le compartiment supérieur pour couvrir la membrane pendant la nuit et à la température ambiante. Avant de plaquer les dissocier tube primaire de Fallope (FT) épithélium (voir ci-dessous) sur les filtres Transwell, se laver les filtres à trois reprises en phosphate de 1X saline tamponnée (PBS) au moins 1 heure avant de l&#39;utiliser pour enlever l&#39;excès de collagène. </li></ol> 2. Collection de tissus et de dissociation. <ol><li> Frais des trompes de Fallope (FT) fimbria doivent être collectés dans stérile PBS 1X dans un tube à centrifuger de 50 ml et conservés sur la glace avant le traitement rapide dans une hotte de culture de tissus stériles. </li><li> Laver l&#39;échantillon de tissu une fois dans 20 ml de PBS 1X froid (si l&#39;échantillon a été recueilli dans un autre type de média ou laver les sanglantes moins 3X pour se débarrasser de beaucoup de sang et que les médias étrangers que possible, car cela pourrait interférer avec l&#39;efficacité placage). </li><li> En utilisant le transfert stériles FT pince à épiler pour un plat de 10 cm de culture de tissu avec un peu de PBS et, en utilisant une pince à épiler scalpel stérile et stérile, coupées longitudinalement pour maximiser l&#39;exposition des cellules épithéliales. Ouvrez le fimbria afin qu&#39;il ne soit plus un tube, mais une feuille presque à plat des tissus. Ensuite, couper en morceaux plus petits mais toujours récupérable (environ 3 mm de diamètre). </li><li> Transfert des morceaux à 45 ml de la dissociation des médias réfrigérée (MEM contenant 1,4 mg / ml pronase et 0,1 mg / ml DNAse) dans un tube de 50 ml. </li><li> Rocher doucement à 4 ° C pendant 24 à 72 heures. (À partir de l&#39;expérience, de 48 heures est optimal). Pour vérifier la quantité de dissociation, mettre une goutte de dissociation des médias sur une lame et vérifiez le montant de l&#39;agglutination et la viabilité des tissus (cellules ciliées battre). Vous voulez voir à la fois des cellules individuelles et quelques petites touffes. </li></ol> 3. Placage trompe de Fallope. <ol><li> Lorsque le montant de la dissociation des cellules épithéliales est optimale, inactiver les médias en ajoutant 10% du volume de FBS. Inverser à quelques reprises pour déloger les cellules en suspension dans de plus petits agrégats. </li><li> Autoriser des touffes importantes de tissus (tissu stromal) de s&#39;installer dans la partie inférieure du tube. Retirez les médias contenant des cellules épithéliales à un seconde Tube 50 ml. </li><li> Ajouter 50 ml de MEM à froid (sans FBS) à l&#39;original tube de 50 ml. Inverser pour recueillir des cellules supplémentaires. Recueillir des médias dans un troisième tube de 50 ml (si l&#39;échantillon est très grand et un nombre élevé de cellules est prévu, cette étape peut être répétée afin de maximiser la collecte de cellules). Les grands morceaux de tissu stromal / extracellulaire peuvent désormais être mis au rebut. Vous avez maintenant deux tubes de 50 ml de suspension cellulaire. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 minutes et aspirer les médias dissociation de culots cellulaires. </li><li> Remettre en suspension dans environ 5-10 ml de USG médias (DMEM: F12 supplémenté avec 2% USG et Pen 1% Strep) chauffé à 37 ° C. Pipette doucement. Attention à ne pas trop vigoureusement la pipette car cela peut endommager les cellules épithéliales et de réduire la qualité des cultures. Il devrait y avoir des cellules individuelles et de petits amas (figure 1). </li><li> Transfert sur des boîtes de culture Primaria et incuber pendant un minimum de 1 heure ou jusqu&#39;à 3 heures. Les fibroblastes et les globules rouges se coller au plastique, mais les cellules épithéliales FT ne sera pas. Jetez un oeil à la plaque après une heure pour voir si quelque chose est collé. La présence de cellules ciliées peuvent être vus en notant le battement des cils. </li><li> Pendant cette incubation, les filtres revêtues de collagène peuvent être lavés et préparés pour le placage de cellules (voir étape 1.4) </li><li> Après 1-3 heures d&#39;incubation sur les plaques Primaria, le transfert de la suspension de cellules dans un tube de 15 ml et rincer la plaque Primaria avec 5 ml de milieu USG, le transfert de ce média dans le tube pour faire un volume final de 15 ml. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Aspirer délicatement les médias et éviter de perturber le culot cellulaire. A en juger par la taille de granulés, remettre en suspension dans la quantité appropriée d&#39;USG médias. (Généralement entre 1-3 ml) Moins est mieux dans le début de sorte que vous pouvez diluer davantage si vous avez besoin. Resuspendre délicatement. </li><li> Ajouter 10 ul de cellules en suspension dans un hématimètre et de déterminer la densité cellulaire. Conseils: Vous recherchez des cellules épithéliales qui ont une membrane cellulaire distinctement sombres et sont non-cylindrique. Vous pouvez également compter les cellules ciliées qui sont certainement le déplacement. Les petites cellules qui ont une auréole appearanCE sont les globules rouges et ne doivent pas être comptés. Il y aura quelques grumeaux, vous avez donc besoin d&#39;estimer que dans le nombre de cellules que vous. L&#39;objectif de semis est de 1,65 x10 5 cellules / membrane, ou au moins 75% de couverture du filtre (figure 1). Si les cellules sont plaquées trop peu densément, les cellules ne sera pas en mesure de former une couche complète épithéliales. </li><li> Ajouter 500 ul de la presse USG au fond du puits d&#39;une plaque de 24 puits et insérez Transwell. Le volume nécessaire de suspension cellulaire FT (voir ci-dessus) peuvent ensuite être ajoutés sur chaque membrane, c&#39;est typiquement 100 pi. </li><li> Incuber et croître pendant 1-2 jours sans déranger dessus de la membrane. Vous pouvez modifier le support sur le côté basale pendant ces jours si nécessaire. Après 1-2 jours, vous pouvez rincer soigneusement le dessus avec USG médias et ajouter une petite quantité (50-100 ul) des médias sur le dessus de la membrane. Il est plus facile de déterminer la confluence des cultures de cellules si le support est enlevé de la partie apicale des filtres avant de microscopie. Le compartiment inférieur doit toujours contenir des médias. Une fois que les cultures sont totalement confluentes (normalement dans les 5 jours), le nombre de médias qui se déplace à travers les filtres de la base aux côtés apicale devrait être négligeable. </li><li> Changer les médias basale fois tous les deux jours pour les 10 premiers jours. Le compartiment inférieur doit toujours avoir les médias pour garder les cellules vivantes. Une fois les cellules ont formé une couche serrée épithéliales (figures 1 et 2) ils peuvent être utilisés dans d&#39;autres études, telles que l&#39;immunofluorescence (IF) ou immunohistochimie (IHC). </li></ol> 4. Traitement membrane. <ol><li> De traitement membranaire est dépendant du type d&#39;étude qui sera effectuée, mais implique généralement l&#39;enlèvement du filtre des inserts Transwell. </li><li> Les filtres sont généralement lavées 3 fois dans 200 ul de PBS 1X avant l&#39;enlèvement. </li><li> Aspirer PBS du côté apical et basal des filtres. Cela devrait être fait une bien à la fois pour éviter les membranes de sécher. </li><li> Retirer l&#39;insert de la plaque, retournez à l&#39;envers et l&#39;utilisation d&#39;un scalpel stériles pour couper autour de la membrane. Essayez d&#39;enlever la membrane en un seul morceau en faisant des coupes droites sur le bord de membrane, au lieu de glisser le scalpel sur le pourtour. </li><li> Utilisez une pince à épiler pour enlever le filtre de l&#39;insert, garder une trace de quel côté les cellules sont allumés. Le filtre peut ensuite être traitées pour IF, IHC, etc, le cas échéant. </li><li> Exemple: pour si des études, le filtre (après fixation, perméabilisation, le blocage et l&#39;incubation avec les anticorps appropriés, conformément à la norme SI procédures) doivent être placés sur une lame, les cellules vers le haut, Vectashield avec DAPI est tombé sur le filtre et recouvert d&#39;une verre de la lamelle. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Les filtres transwell peut être facilement enlevé pour examiner l&#39;épithélium ex vivo par les deux immunohistochimie (IHC) et l&#39;immunofluorescence (IF). En utilisant la lignée des marqueurs spécifiques, on peut d&#39;image et de quantifier la sécrétion (PAX8 positif) et ciliées (Sall2 positif) des compartiments cellulaires dans ces cultures (figure 3). Par ailleurs, l&#39;utilisation de ces marqueurs, on peut surveiller la façon dont chaque type de cellule répond à différents signaux physiologiques 10. Ce système a été utilisé pour caractériser les changements dans les phosphoprotéome sécrétome et intracellulaire de l&#39;épithélium FT en réponse à divers stimuli. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Illustration de la manière dont l&#39;ex vivo cultures sont générées à partir des tissus primaires tube de Fallope humaines. Tissus trompe de Fallope fimbriae est obtenu à partir du bloc opératoire et émincé de générer de petits fragments 1 qui sont lavées et incubées avec la dissociation des médias pendant 24-72 heures 2. Après la dissociation est complète, les fragments de tissus sont autorisés à se déposer au fond du tube d&#39;incubation et les médias contenant les cellules épithéliales dissociées est récolté 3. L&#39;efficacité de la dissociation peuvent être surveillés par un examen au microscope de 4 à contraste de phase. Les cellules épithéliales dissociées sont ensuite cultivées sur des plaques Primaria pour aider à éliminer des fibroblastes et les cellules hématopoïétiques qui, invariablement, mélangés avec les cellules épithéliales 5. Une fois les cellules non épithéliales sont suffisamment retiré, les cellules épithéliales sont ensemencés sur des filtres transwell qui sont revêtus de collagène placentaire humaine 5. Les médias sont fournies par diffusion à travers la transwell d&#39;en bas. Les cultures sont incubées pendant 24-48 heures, puis les médias apicale est enlevé. Les cultures ex vivo sont alors autorisés à croître pendant 5-8 jours pour former un plein complet sur ​​la pelouse filtres transwell. Les cultures ex vivo peut être maintenu dans cet état ​​viable pour un maximum de 4 semaines. La caricature 5 montre une représentation de la culture ex vivo entièrement développé avec un exemple d&#39;un filtre retiré de l&#39;insert et colorées avec hématoxylin et l&#39;éosine (H &amp; E) pour démontrer la polarité et de l&#39;architecture de l&#39;épithélium ex vivo. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Microscopie à champ lumineux des cultures FT ex vivo. Inserts Transwell sont revêtues de placenta humain pores 0.4μm collagène sont visibles (a). Cellules épithéliales FT sont cultivés sur les inserts revêtues de collagène (b), où ils forment une couche épithéliale (c). Certains débris sont normalement observées adhérer aux cellules épithéliales de la culture (indiquées par des flèches), le plus souvent des cellules ciliées. <img src="/files/ftp_upload/2728/2728fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. FT ex vivo la culture immunofluorescence (IF). Exemples de SI images des cultures ex vivo fixées et colorées avec des anticorps contre (a) sécrétoire (PAX8) et (d) des cellules ciliées (Sall2) marqueurs. DAPI est utilisé comme un contrôle pour l&#39;emplacement des noyaux cellulaires (bleu) (B et E) et l&#39;anticorps fusionné et coloration DAPI est également indiqué (C et F). Le nombre de cellules dépend de la longueur de temps les cellules sont en culture (PAX8 coloration, 7 jours; Sall2 coloration, 3 jours).

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Dr Drapkin est un consultant pour Novartis Pharmaceuticals. Pas d&#39;autres auteurs déclarer tout conflit d&#39;intérêts potentiel.

L&#39;identification de la FT comme site candidat d&#39;origine pour SOC offre la possibilité de la recherche fondamentale et translationnelle visant à décrypter les mécanismes reliant les facteurs de risque connus et le processus de réelles séreuse cancérigènes. Critique pour ce est le développement de systèmes de modèle souple qui va nous permettre de commencer à tester l&#39;hypothèse que le FTSEC est une cellule d&#39;origine pour les carcinomes séreux pelvienne. Le modèle ex vivo culture décrit ici est un nouveau système qui permet l&#39;isolement et la co-culture de sécrétion FT primaires et cellules ciliées dans une manière qui préserve la morphologie et la biologie de l&#39;épithélium FT natale. Grâce à ce système, nous avons récemment caractérisé l&#39;sécrétome de cet épithélium et la façon dont l&#39;épithélium répond aux blessures mécaniques et génotoxiques 10. L&#39;ovulation, un facteur de risque majeur associé à la tumorigenèse de l&#39;ovaire, est caractérisée par une combinaison de lésions des tissus, des médiateurs inflammatoires, facteurs de croissance et les hormones 11. Ce système pourrait être utilisé pour étudier l&#39;effet d&#39;un milieu sur la réponse ovulatoire et la viabilité des cellules ciliées et sécrétoires. En outre, l&#39;impact des autres types de cellules (cellules inflammatoires) pourraient être examinés afin de permettre une meilleure compréhension des événements qui animent la cellule de type de différenciation et les facteurs qui contribuent à la transformation néoplasique de ces cellules. Des modèles semblables ont été décrits dans d&#39;autres tissus où l&#39;épithélium polarisé est présent. Par exemple, dans des cultures primaires de polarisation épithélium des voies respiratoires, l&#39;effet de hereguline sur la croissance cellulaire et la réponse aux lésions cellulaires a été évaluée 12. Ces types de systèmes modèles fournissent une manière nouvelle et utile d&#39;étudier l&#39;initiation et la pathogénie des tumeurs qui proviennent de tissus épithéliaux, et cela est d&#39;une importance cruciale dans les tissus tels que le FT où aucune des lignées de cellules existent actuellement, et où il ya une grande nécessité pour l&#39;identification des principales voies et le développement de nouvelles stratégies de traitement.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C7521</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DMEM:F12 media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>15-090-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultroser G</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Crescent Chemical Company</td>
<td>67042</td>
<td>Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pen Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Primaria culture plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Bioscience</td>
<td>353802</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 well Transwell Permeable supports</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning (Costar)</td>
<td>3470</td>
<td> Clear, 6.5 mm insert, 0.4 &mu;m pore size, treated polyester </td>
</tr>
<tr>
<td>MEM (Minimal Essential Media)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cellgro</td>
<td>10-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pronase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>11459643001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DNAse</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>DN25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sall2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dr T. Benjamin, Harvard</td>
<td>Gift</td>
<td>1:20 dilution</td>
</tr>
<tr>
<td>Pax8 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Proteintech</td>
<td>10336-1-AP</td>
<td>1: 1000 dilution</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells

Le cancer ovarien épithélial est une cause majeure de mortalité par cancer des femmes aux États-Unis. Contrairement à d&#39;autres femmes les cancers spécifiques, comme la poitrine et les carcinomes de l&#39;utérus, où les taux de mortalité ont diminué ces dernières années, les taux de cancer de l&#39;ovaire guérir sont demeurés relativement inchangés au cours des deux dernières décennies 1. Ceci est largement dû à l&#39;absence d&#39;outils de dépistage appropriés pour la détection de la maladie au stade précoce où la chirurgie et la chimiothérapie sont les plus efficaces 2, 3. En conséquence, la plupart des patients présentent une maladie stade avancé et diffuse l&#39;implication abdominale. Cette situation est encore compliquée par le fait que le cancer de l&#39;ovaire est une maladie hétérogène avec de multiples sous-types histologiques 4, 5. Carcinomes ovariens séreux (SOC) est le sous-type le plus commun et agressif et la forme la plus souvent associée à des mutations dans les gènes BRCA. Courant modèles expérimentaux dans ce domaine impliquent l&#39;utilisation de lignées cellulaires de cancer et de modèles de souris pour mieux comprendre les événements déclencheurs génétique et la pathogenèse de la maladie de 6, 7. Récemment, la trompe de Fallope a émergé comme un nouveau site pour l&#39;origine du SOC, avec la trompe de Fallope (FT) de cellules épithéliales sécrétoires (FTSEC) que la cellule d&#39;origine proposé 8, 9. Il n&#39;y a actuellement aucune des lignées cellulaires ou des systèmes de culture disponibles pour étudier l&#39;épithélium FT ou l&#39;FTSEC. Nous décrivons ici un roman de culture in vivo ex système où les cellules primaires épithéliales humaines FT sont cultivées dans une manière qui préserve leur architecture, de la polarité, immunophénotype, et la réponse au stress physiologique et génotoxiques. Ce modèle ex vivo fournit un outil utile pour l&#39;étude de la SOC, permettant une meilleure compréhension de la façon dont les tumeurs peuvent survenir à partir de ce tissu, et les mécanismes impliqués dans l&#39;initiation et la progression tumorale.

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Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

Les trompes de Fallope (FT) se profile comme un site alternatif d&#39;origine d&#39;un carcinome ovarien séreux (SOC). Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour l&#39;isolement et<em&gt; Ex vivo</em&gt; Culture de cellules épithéliales des trompes de Fallope. Ce système reprend le<em&gt; In vivo</emL&#39;épithélium&gt; et permet l&#39;étude de la pathogenèse du COS.

Culture ex vivo des cellules humaines primaires épithéliales des trompes de Fallope

Epithelial ovarian cancer is a leading cause of female cancer mortality in the United States. In contrast to other women-specific cancers, like breast and ...

ex-vivo-culture-of-primary-human-fallopian-tube-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Ex Vivo Culture of Primary Human Fallopian Tube Epithelial Cells

19.5K vues.  Dana-Farber Cancer Institute. Les trompes de Fallope (FT) se profile comme un site alternatif d'origine d'un carcinome ovarien séreux (SOC). Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour l'isolement et Ex vivo Culture de cellules épithéliales des trompes de Fallope. Ce système reprend le In vivo

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Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Méthode pour la culture d&#39;embryons de poulet Early ex vivo (Nouvelle Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

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Biologie

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primaire cellules épithéliales bronchiques humaines Cultivé à partir d&#39;explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolement et culture des cellules souches épithéliales adultes de la peau humaine

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviraux médiée Knockdown cours Ex Vivo</emÉrythropoïèse> des cellules souches hématopoïétiques humaines

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts migrate through the epidermis of the embryo where they subsequently colonize the developing hair follicles1,2. Neural crest cell migration is extensively studied in vitro but in vivo methods are still not well developed, especially in mammalian systems. One alternative is to use ex vivo organotypic culture3-6. Culture of mouse embryonic skin requires the maintenance of an air-liquid interface (ALI) across the surface of the tissue3,6. High resolution live-imaging of mouse embryonic skin has been hampered by the lack of a good method that not only maintains this ALI but also allows the culture to be inverted and therefore compatible with short working distance objective lenses and most confocal microscopes. This article describes recent improvements to a method that uses a gas permeable membrane to overcome these problems and allow high-resolution confocal imaging of embryonic skin in ex vivo culture6. By using a melanoblast specific Cre-recombinase expressing mouse line combined with the R26YFPR reporter line we are able to fluorescently label the melanoblast population within these skin cultures. The technique allows live-imaging of melanoblasts and observation of their behavior and interactions with the tissue in which they develop. Representative results are included to demonstrate the capability to live-image 6&#160;cultures in parallel.

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

We describe the dissection and ex vivo culture of mouse embryonic skin. The culture system maintains an air-liquid interface across the tissue surface and allows imaging on an inverted microscope. Melanoblasts, a component of the developing skin, are fluorescently labeled allowing their behavior to be observed using confocal microscopy.

Ex vivo Culture de la peau de souris embryonnaires et Live-imagerie de la migration mélanoblaste

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Optimal Lentivirus Production et culture cellulaire Conditions nécessaires pour réussir Cellules transduction humains primaires épithéliales bronchiques

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Multicellular Human Alveolar Model Composed of Epithelial Cells and Primary Immune Cells for Hazard Assessment

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II cells and two types of immune cells (i.e., human monocyte-derived macrophages [MDMs] and dendritic cells [MDDCs]). A protocol for assembling the multicellular model is provided. Alveolar epithelial cells (A549 cell line) are grown and differentiated under submerged conditions on permeable inserts in two-chamber wells, then combined with differentiated MDMs and MDDCs. Finally, the cells are exposed to an air-liquid interface for several days. As human primary immune cells need to be isolated from human buffy coats, immune cells differentiated from either fresh or thawed monocytes are compared in order to tailor the method based on experimental needs. The three-dimensional models, composed of alveolar cells with either freshly isolated or thawed monocyte-derived immune cells, show a statistically significant increase in cytokine (interleukins 6 and 8) release upon exposure to proinflammatory stimuli (lipopolysaccharide and tumor necrosis factor &#945;) compared to untreated cells. On the other hand, there is no statistically significant difference between the cytokine release observed in the cocultures. This shows that the presented model is responsive to proinflammatory stimuli in the presence of MDMs and MDDCs differentiated from fresh or thawed peripheral blood monocytes (PBMs). Thus, it is a powerful tool for investigations of acute biological response to different substances, including aerosolized drugs or nanomaterials.

Presented here is a protocol for primary human blood monocyte isolation as well as their differentiation into macrophages and dendritic cells and assembly with epithelial cells into a multicellular human lung model. Biological responses of cocultures composed of immune cells differentiated from either freshly isolated or thawed monocytes, upon exposure to proinflammatory stimuli, are compared.

Modèle alvéolaire humain multicellulaire composé de cellules épithéliales et de cellules immunitaires primaires pour l’évaluation des risques

A human alveolar cell coculture model is described here for simulation of the alveolar epithelial tissue barrier composed of alveolar epithelial type II ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolement et enrichissement des cellules progénitrices épithéliales pulmonaires humaines pour la culture organoïde

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...

Isolation, Culture, and Genetic Engineering of Mammalian Primary Pigment Epithelial Cells for Non-Viral Gene Therapy

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a multifactorial disease influenced by environmental and genetic factors, which lead to functional impairment of the retina due to retinal pigment epithelial (RPE) cell degeneration followed by photoreceptor degradation. An ideal treatment would include the transplantation of healthy RPE cells secreting neuroprotective factors to prevent RPE cell death and photoreceptor degeneration. Due to the functional and genetic similarities and the possibility of a less invasive biopsy, the transplantation of iris pigment epithelial (IPE) cells was proposed as a substitute for the degenerated RPE. Secretion of neuroprotective factors by a low number of subretinally-transplanted cells can be achieved by Sleeping Beauty (SB100X) transposon-mediated transfection with genes coding for the pigment epithelium-derived factor (PEDF) and/or the granulocyte macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF). We established the isolation, culture, and SB100X-mediated transfection of RPE and IPE cells from various species including rodents, pigs, and cattle. Globes are explanted and the cornea and lens are removed to access the iris and the retina. Using a custom-made spatula, IPE cells are removed from the isolated iris. To harvest RPE cells, a trypsin incubation may be required, depending on the species. Then, using RPE-customized spatula, cells are suspended in medium. After seeding, cells are monitored twice per week and, after reaching confluence, transfected by electroporation. Gene integration, expression, protein secretion, and function were confirmed by qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence, and functional assays. Depending on the species, 30,000-5 million (RPE) and 10,000-1.5 million (IPE) cells can be isolated per eye. Genetically modified cells show significant PEDF/GM-CSF overexpression with the capacity to reduce oxidative stress and offers a flexible system for ex vivo&#160;analyses and in vivo studies transferable to humans to develop ocular gene therapy approaches.

Here, a protocol to isolate and transfect primary iris and retinal pigment epithelial cells from various mammals (mice, rat, rabbit, pig, and bovine) is presented. The method is ideally suited to study ocular gene therapy approaches in various set-ups for ex vivo&#160;analyses and&#160;in vivo studies transferable to humans.

Isolement, culture et génie génétique de cellules épithéliales pigmentaires primaires de mammifères pour la thérapie génique non virale

Age-related macular degeneration (AMD) is the most frequent cause of blindness in patients &#62;60 years, affecting ~30 million people worldwide. AMD is a ...

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to understand the pathophysiology of ocular diseases because of their similarities with human anatomy and physiology. Alterations in the retinal pigment epithelium (RPE), including changes in morphology and function, are common features shared by many ocular disorders. However, successful isolation and culture of primary mouse RPE cells is very challenging. This paper is an updated audiovisual version of the protocol previously published by Fernandez-Godino et al. in 2016 to efficiently isolate and culture primary mouse RPE cells. This method is highly reproducible and results in robust cultures of highly polarized and pigmented RPE monolayers that can be maintained for several weeks on Transwells. This model opens new avenues for the study of the molecular and cellular mechanisms underlying eye diseases. Moreover, it provides a platform to test therapeutic approaches that can be used to treat important eye diseases with unmet medical needs, including inherited retinal disorders and macular degenerations.

This protocol, which was originally reported by Fernandez-Godino et al. in 20161, describes a method to efficiently isolate and culture mouse RPE cells, which form a functional and polarized RPE monolayer within one week on Transwell plates. The procedure takes approximately 3 hours.

Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Eye disorders affect millions of people worldwide, but the limited availability of human tissues hinders their study. Mouse models are powerful tools to ...