Nos méthodes décrivent une façon simple et répétée d’étudier la nanotoxicité, comme l’examen des types de mort cellulaire et l’examen de la production d’espèces réactives d’oxygène. Le tri cellulaire activé par fluorescence est un format strict qui nous permet d’étudier la sous-population des cellules et les différents types croissants de mort cellulaire. La méthode d’étude de la sonde DHE nous permet de détecter et de quantifier les espèces réactives d’oxygène suivies de la cytométrie du débit, de l’imagerie microscopique à haute teneur et de l’analyse de fluorescence à base de couplet.
Pour commencer, placez un tube d’Eppendorf contenant des nanoparticules d’oxyde de zinc dans la solution de stock de nanoparticules d’oxyde de zinc dans un sonicateur pendant 15 minutes. Préparer les nanoparticules d’oxyde de zinc à diverses concentrations à l’aide d’un milligramme par millilitre de stock de nanoparticules d’oxyde de zinc. Puis, dans un cabinet de biosécurité, les fibroblastes pulmonaires humains MRC5 se plantent sur trois plaques de culture de six puits à la concentration d’une fois 10 à la cinquième cellule par puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius. Après une journée, traiter les cellules avec deux millilitres de nanoparticules d’oxyde de zinc pendant huit heures, 16 heures ou 24 heures. À chaque fois, recueillir les cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres, et centrifugeuse à 300 fois g pendant cinq minutes.
Lavez les granulés cellulaires deux fois avec de la solution saline tamponnée de phosphate, puis résépendez les cellules avec un tampon de liaison 1X. Ensuite, ajoutez cinq microlitres de tache fitc annexine V dans cinq microlitres de tache d’ADN iodure de propidium. Incuber les cellules tachées pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité.
Avant de trier les cellules par cytométrie d’écoulement, rechargez les échantillons avec 400 microlitres supplémentaires de tampon de liaison 1X. Tabuler le graphique à barres en utilisant l’intensité médiane obtenue. Utilisez maintenant une pipette pour ajouter un millilitre de nanoparticules à différentes concentrations en flacons, suivie de neuf millilitres de mouches pour faire une concentration finale de 0,1 milligramme par millilitre, 0,25 milligramme par millilitre, ou 0,5 milligramme par nanoparticules d’oxyde de zinc millilitre.
Pipette de haut en bas pour bien mélanger. Laisser refroidir les aliments volants contenant des nanoparticules d’oxyde de zinc pendant au moins deux à trois heures avant utilisation. Anesthésiez ensuite les mouches mâles et femelles adultes dans un flacon avec du dioxyde de carbone, et introduisez cinq mouches mâles et cinq mouches femelles dans chaque flacon pendant cinq jours.
Laissez-les s’accoupler et pondre des œufs à la surface de la nourriture. Après l’anesthésie, enlever les mouches parentales et permettre aux œufs de subir un développement ultérieur à température ambiante, qui se compose de quatre stades de développement différents. Stade embryonnaire, larvaire, pupal et adulte.
Après 72 à 120 heures, les œufs fraîchement pondus se développent en larves tardives du troisième stade. À l’aide de forceps, recueillir les larves de la paroi des flacons pour les analyses. Dans un puits d’un plat de dissection avec milieu de dissection ou PBS, placez les larves dans la solution.
Sous le stéréomicroscope, utilisez le bout des forceps pour faire un petit trou et ouvrez la couche cuticule des larves. Retirez soigneusement l’intestin. Placez l’intestin dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant le Drosophila Medium de Schneider.
Ajouter un microlitre de la sonde DHE et incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 10 minutes. Lavez l’intestin trois fois à l’aide du medium de Schneider toutes les cinq minutes. Montez l’intestin sur des glissières en verre et fournissez 10 microlitres de support antifade contenant du DAPI.
Capturez des images au microscope confocal. Pour mesurer la fluorescence, importez les images de fluorescence capturées acquises à l’aide d’une microscopie fluorescence ou d’une microscopie à balayage laser confocal dans le logiciel ImageJ. Cliquez sur le menu analyser et sélectionnez les mesures définies.
Sélectionnez la mesure de sortie, telle que l’intensité intégrée de la zone et la valeur grise moyenne. Sélectionnez une région sans fluorescence pour définir l’arrière-plan. Cliquez sur la mesure.
Exportez les données dans la feuille de calcul et déterminez la fluorescence cellulaire totale corrigée. Construisez un diagramme à barres et effectuez une analyse statistique. Dans cette étude, les cellules traitées par nanoparticules d’oxyde de zinc présentent un pourcentage plus élevé de cellules R3 ou R6 apoptotiques tardives que les cellules de contrôle R5. La mort des cellules nécrotiques a été notée par R4. L’intestin extrait de la larve de drosophile a été divisé en trois domaines discrets d’origine développementale différente.
À savoir, le foregut, midgut, et hindgut. Le stock DHE a tendance à expirer assez rapidement, alors faites attention à la solution de stock que vous utilisez. Alternativement, vous pouvez essayer d’autres sondes, par exemple la cellule Roche, qui est conçu pour détecter le ROS intracellulaire dans les signaux verts, et qui est plus photostable que le DHE.
Notre protocole fournit un aperçu général pour l’étude de la production intracellulaire de ROS, et la quantification du niveau de ROS pour l’étude de nanotoxicité. DMSO est connu pour être un meilleur solvant pour DHE que le PBS. Cependant, DMSO est toxique.
Par conséquent, je voudrais conseiller à l’utilisateur de limiter l’ensemble du processus d’étude à 30 minutes maximum. C’est parce que vous pouvez observer un résultat faussement positif que DMSO peut causer la mort cellulaire.
