Le protocole présenté permet de quantifier une large gamme de lipides dans les tissus animaux. C’est un outil facile pour étudier les mécanismes lipidiques et aussi pour identifier un biomarqueur indiquant une toxicité précoce dans des modèles animaux. La méthode fournit un profil quantitatif de plus de 400 lipides moléculaires dans 14 classes de lipides différentes dans une grande variété de matrices d’échantillons avec un temps de tendance de 10 minutes par échantillon.
Pour commencer, diluer le surnageant aliquote 1 aliquotge 1 par rapport à la concentration avec un tampon de bicarbonate d’ammonium. Après avoir préparé la courbe standard de l’albumine sérique bovine, vortex les tubes étalons et centrifuger les tubes à 18,200 g pendant 15 secondes à température ambiante. À partir des tubes standard préparés précédemment, transférer 6 microlitres chacun des ébauches, des étalons et des échantillons sur une plaque à fond plat à 96 puits.
Ensuite, ajoutez 250 microlitres du réactif Bradford à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal et mélangez. Après l’incubation pendant 5 minutes, mesurez l’absorbance à une longueur d’onde de 595 nanomètres à l’aide d’un lecteur de plaques. Préparer des tubes de 2 millilitres avec 100 microlitres de solution de bicarbonate d’ammonium dans chaque tube de l’ébauche totale et de l’ébauche étalon interne et conserver tous les échantillons sur la glace.
Préparer des échantillons de contrôle de la qualité, en considérant qu’un échantillon de contrôle de la qualité est placé entre chaque ensemble de 10 échantillons. Ajouter 10 microlitres de plasma humain mélangé à des tubes de 2 millilitres, puis ajouter 10 microlitres de solution étalon interne dans tous les échantillons blancs étalons internes, de contrôle de la qualité et d’étude. Ajouter 300 microlitres de mélange de butanol et de méthanol moins 20 degrés Celsius à chaque échantillon et agiter à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante sur thermomélangeur.
Ensuite, ajoutez 300 microlitres de mélange d’acétate d’heptane d’éthyle et agitez à 450 g pendant 10 minutes à température ambiante sur le thermomélangeur, puis ajoutez 300 microlitres de mélange d’acide ascétique à 1% et agitez pendant 5 minutes à 450 g à température ambiante sur le thermomélangeur. Centrifuger à 2 800 g pendant 5 minutes à température ambiante et transférer 360 microlitres de la phase supérieure dans un nouveau tube autobloquant de 2 millilitres étiqueté 2. Après avoir ajouté 320 microlitres d’acétate d’heptane d’éthyle au tube en phase aqueuse marqué comme 1, agiter à 450 g pendant 5 minutes à température ambiante sur le thermomélangeur, puis centrifuger à 2 800 g pendant 5 minutes à température ambiante comme démontré précédemment.
Transférez 320 microlitres de la phase supérieure et combinez-les avec la fraction de l’étape précédente dans le tube 2. De même, ajouter 250 microlitres d’acétate d’heptane éthyle à la phase aqueuse dans le tube 1 et agiter à 450 g pendant 5 minutes à température ambiante sur le thermomélangeur. Encore une fois, centrifuger à 2 800 g pendant 5 minutes à température ambiante, puis transférer 200 microlitres de la phase supérieure et le combiner avec les fractions des étapes précédentes dans le tube 2.
Évaporer à sec à 35 degrés Celsius dans un concentrateur sous vide et dissoudre à nouveau dans 300 microlitres de solution de mélange MS. Vortex chaque tube pendant 5 secondes pour s’assurer que tout est dissous et centrifuger à 18, 200 g pendant 5 minutes à 4 degrés Celsius. Transférer une partie aliquote de 50 microlitres dans la plaque de microlitre pour l’analyse du mode d’ionisation positive et diluer avec 50 microlitres de solution de mélange MS.
Encore une fois, diluer avec 80 microlitres de mélange MS et transférer une partie aliquote de 20 microlitres dans la plaque MTP pour l’analyse du mode d’ionisation négative. Envelopper la plaque avec du papier d’aluminium et conserver à 4 degrés Celsius avant l’analyse. Calibrer une SM en mode positif et négatif conformément aux instructions du fabricant 5 jours ou moins avant l’analyse.
Installez la nano-source de perfusion directe dès le départ, en vous assurant qu’elle est correctement alignée contre le capillaire de transfert de la SM et une puce de buse de 4,1 micromètres dans le porte-puce, puis vérifiez les paramètres de perfusion positive et négative correspondant à une pression de gaz de 1,25 psi, une tension source de 1,1 kilovolt, 5 microlitres de volume d’injection de l’échantillon, fermeture du contact de sortie Rel1 pendant 2,5 secondes, 5 minutes de délai de livraison, refroidissement de la plaque à 4 degrés Celsius, puis réglage du régulateur de température et création d’une nouvelle plaque. Pour le mode positif, vérifiez et réglez le logiciel que la méthode MS est configurée avec une température capillaire de 250 degrés Celsius et le niveau RF de l’objectif S à 65,0. Dans le logiciel Xcalibur, ouvrez la méthode positive et vérifiez que l’acquisition MS à balayage complet est configurée de zéro à 1 minute dans la plage de 550 à 1 000 m / z à une résolution de 140 000 avec un contrôle de gain automatisé de 1 million et un temps d’injection maximum de 50 millisecondes.
Appliquer la masse de verrouillage de 680.48022. Vérifiez que la méthode d’acquisition MS/MS indépendante des données est configurée entre la plage de temps de 1 et 5 minutes à une résolution de 17 500 avec une première masse fixe de 250 m/z. Vérifier que le contrôle de gain automatisé pour MS2 est réglé à 100 000 et un temps d’injection maximum à 64 millisecondes, une énergie de collision de 20 NCE, la fenêtre d’isolement à 1 m/z et qu’une liste de masse d’inclusion de 398 à 1 100 m/z est utilisée avec un pas de masse de 1 Dalton.
Pour l’acquisition en mode négatif, vérifiez dans le logiciel de réglage que la méthode MS est configurée avec la température capillaire à 250 degrés Celsius dans le niveau RF de l’objectif S à 65,0 dans le fichier de réglage MS. Ensuite, dans le logiciel Xcalibur, vérifiez que le mode d’acquisition à balayage complet est configuré de zéro à 1 minute à une résolution de 140 000 couvrant la plage de 400 à 940 m/z, un contrôle de gain automatisé de 1 million, un temps d’injection maximal de 200 millisecondes et une masse de verrouillage de 526,46262. Vérifiez que l’acquisition MS2 en mode DIA est configurée entre 1 et 5 minutes de course à une résolution de 17 500 avec une première masse fixe de 150 m/z, un contrôle de gain automatisé de 100 000, 64 millisecondes de temps d’injection maximum et 35 NCE d’énergie de collision en utilisant la liste de masse d’inclusion de 400 à 940 avec un pas de masse de 1 Dalton.
Créez la file d’attente de séquence d’analyse dans le logiciel Xcalibur en mode positif et déclenchez-la, puis créez la séquence dans le logiciel ChipSoft et démarrez l’analyse en attendant que l’acquisition de l’échantillon soit déclenchée par un signal de fermeture de contact provenant du robot de perfusion directe pour chaque échantillon. Lorsque l’analyse en mode positif est terminée, créez la file d’attente de séquence d’analyse dans le logiciel Xcalibur en mode négatif et déclenchez-la, puis créez la séquence dans le logiciel ChipSoft et démarrez l’analyse en attendant que l’acquisition de l’échantillon soit déclenchée par un signal de fermeture de contact provenant du robot de perfusion directe pour chaque échantillon. La concentration totale normalisée de lipides a été identifiée et quantifiée à partir des 14 classes de lipides les plus abondantes, qui était légèrement élevée pour les classes de lipides PE, PEO, PC, PCO, PI et PG et une certaine régulation à la baisse a été observée pour les lipides SM, LPE et PA.
Bien qu’aucune différence n’ait pu être observée pour les TAG et les PS. Ces résultats montrent également que, parmi les caractéristiques moléculaires basées sur la formule moléculaire totale, 100 à 120 composés ont été significativement affectés par l’exposition à la fumée de cigarette. La déconvolution de la fragmentation MS2 et la normalisation des intensités du signal fragmenté ont permis de définir approximativement la quantité totale de chaque acide gras conjugué représenté dans chaque verre lipidique et de comparer ces données entre les groupes exposés et témoins. Une diminution des acides gras complètement saturés et peu d’acides gras insaturés a été observée, tandis que les acides gras polyinsaturés dans la composition des classes de phospholipides PC, PE et PG étaient élevés dans le groupe de la fumée de cigarette pour tous les points temporels.
Les cas extrêmes de PC et de PG conjugués avec de l’acide eicosapentaénoïque et docosahexaénoïque ont été détectés exclusivement dans le groupe d’exposition 3R4F CS. Le pipetage de l’échantillon et de l’échantillon de CQ doit être effectué avec des pointes à bande basse et pour être précis, ce qui signifie que les pointes doivent être vérifiées entre chaque échantillon. Le pipetage de la solution étalon interne est critique et doit être précis.
La solution de méthanol dichlorométhane 1 à 1 doit être manipulée avec précaution et un embout contenant des éléments non plastifiants doit être utilisé pour éviter la présence de polymères plastiques dans les échantillons. Les pointes doivent être changées entre chaque échantillon.
