Ce protocole permet la quantification des gouttelettes lipidiques et l’analyse de leur morphologie et de leur distribution subcellulaire d’une manière spécifique au type de fibre. Cette technique permet le traitement simultané de différents muscles, ce qui permet de gagner du temps et d’éviter les artefacts qui pourraient survenir lorsqu’ils sont traités indépendamment. Il permet également l’automatisation de la quantification des gouttelettes lipidiques.
La myostéatose a été évaluée dans les muscles marins, mais ce protocole pourrait être traduit chez l’homme dans différentes conditions, telles que l’obésité, le vieillissement et le cancer. Reconnaître les mêmes fibres en section parallèle pourrait être difficile, mais des structures remarquables telles que des ajustements axonals ou des fuseaux musculaires sont de bons repères qui aideront le chercheur à localiser les mêmes fibres sur les deux lames. Pour commencer, placez deux sections transversales cryogelées en série de l’échantillon musculaire sur deux lames d’adhérence pré-marquées.
Une diapositive pour déterminer les types de fibres et l’autre pour quantifier la teneur en lipides. Pour la détection immunohistochimique du type de fibre musculaire, entourez les sections d’un contour dessiné avec un stylo hydrophobe. Placez-le dans une chambre humide et rincez avec du PBS 0,1 molaire glacé pendant une minute à température ambiante.
Ensuite, retirez le PBS, ajoutez la solution bloquante à la lame et incubez pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Plus tard, retirez la solution bloquante et incubez les lames pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius avec la solution contenant les anticorps primaires. Lavez les lames trois fois avec du PBS pendant cinq minutes chacune, à température ambiante.
Ajouter la solution contenant les anticorps secondaires et incuber les lames dans l’obscurité pendant une heure à température ambiante, puis assurer de garder la lame à l’abri de la lumière et procéder aux trois lavages dans pbS pendant cinq minutes chacun, puis rincer la lame dans de l’eau double distillée, après avoir retiré l’excès d’eau, monter la lame avec un réactif antifade et la stocker à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Pour tacher la gouttelette lipidique avec du corps, entourez la section musculaire d’un contour dessiné par un stylo hydrophobe avant de la rincer avec du PBS 0,1 molaire glacé pendant 10 minutes. Les deux diapositives doivent être colorées simultanément.
Fixez la section avec du paraformaldéhyde froid à quatre pour cent sans méthanol pendant 10 minutes à température ambiante. Après le premier rinçage rapide, lavez les lames trois fois avec du PBS pendant cinq minutes. Bloquez la lame avec 5% de sérum de chèvre normal dans le PBS pendant une heure dans la chambre humaine.
Suivi de l’incubation de la lame avec la solution de l’anticorps primaire comprenant 2% de sérum de chèvre normal et d’anti-laminine de rat dans le PBS pendant 90 minutes. Après avoir lavé les lames trois fois dans le PBS, effectuez l’incubation suivante avec la solution d’anticorps secondaire contenant l’anticorps de chèvre, anti-rat, Alexa fluor 647 dans le PBS à température ambiante pendant une heure. Assurez-vous que la glissière est protégée de la lumière.
Après l’incubation, laver la lame trois fois avec du PBS. Ensuite, incubez la section pendant 20 minutes avec une solution dapi et corsée. Après un rinçage rapide, laver trois fois avec du PBS, et une fois avec de l’eau distillée double, puis retirer l’excès d’eau et monter la section avec un réactif anti-décoloration.
Une fois le muscle numérisé, téléchargez les images numériques capturées dans n’importe quel logiciel de traitement d’image pour la reconstruction. Sur la base de la morphologie des fibres et de l’histologie de la section musculaire, enregistrez l’image dans un format approprié avec tous les canaux fusionnés. Pour l’observation et l’acquisition d’images corporelles, définissez les paramètres d’un microscope confocal, avec un objectif à immersion dans l’huile 40 X et une ouverture numérique de 1,4, comme décrit dans le manuscrit.
Pour éviter la diaphonie entre bodipy et 558, 568 et laminin Alexa fluor 647; Utilisez le mode de balayage séquentiel sur le logiciel confocal. Exciter bodipy et 493, 503 en utilisant la ligne laser de 488 nanomètres ou la ligne laser argon, et exciter bodipy et 555, 568 en utilisant la ligne laser à diode de 561 nanomètres. Enfin, détectez la laminine Alexa fluor 647 avec une ligne laser à diode de 640 nanomètres, selon le colorant choisi, réglez les taux d’émission à 570 à 650 nanomètres pour le corsage et 493, 503.
Et à 565 à 620 nanomètres pour le corsage et 558, 568. Réglez la plage d’émission de la laminine entre 656 et 700 nanomètres. Ensuite, réglez le gain et le gain numérique de manière appropriée pour éviter de détecter les pixels saturés sur l’indicateur de plage.
Corrigez le signal d’arrière-plan en ajustant le décalage. Pour identifier le type de fibre sur le microscope confocal, utilisez un ordinateur portable sur lequel l’image de la lame précédemment reconstruite avec la détection immunologique de type fibre peut être vérifiée. Une fois qu’un groupe de fibres est correctement identifié, acquérez l’image avec les canaux corsé et laminine.
Ouvrez chaque image à l’aide de l’importateur du bioformat des Fidji. Sous la pile d’affichage avec option, sélectionnez hyper pile, puis mode couleur et valeur par défaut. Assurez-vous que la fenêtre de mise à l’échelle automatique est sélectionnée.
Utilisez l’outil de sélection à main levée pour sélectionner manuellement le sarcolemme de la fibre en fonction du canal de laminine. Et appuyez sur T sur le clavier pour enregistrer la région d’intérêt dans la fenêtre ROI. Allez dans la fenêtre principale de Fidji et cliquez sur analyser et définir des mesures.
Ensuite, dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez la zone et pour le diamètre surélevé, laissez les cases restantes décochées et les autres paramètres tels qu’ils apparaissent par défaut. Cliquez sur mesure dans la fenêtre ROI pour obtenir la surface et le diamètre minimal de la fibre sélectionnée et les noter pour une utilisation ultérieure. Calculez la valeur d’un sixième du diamètre minimal pour le diamètre surélevé afin de délimiter la partie centrale de la fibre.
Cliquez sur la fenêtre ROI, Cliquez sur ajouter pour avoir un duplicata du premier ROI et sélectionnez le deuxième ROI qui apparaît sur la fenêtre. Dans la fenêtre principale des Fidji, cliquez sur modifier, puis sur Sélectionner et agrandir. Pour introduire la valeur précédemment calculée avec un signe moins avant le nombre et cliquez sur OK.
Dans la fenêtre ROI, cliquez sur ajouter, Un troisième ROI doit apparaître, et supprimer pour supprimer le deuxième ROI. Dans la fenêtre ROI sélectionnez les deux ROI et cliquez sur plus puis ZOR et ajoutez, attendez qu’un troisième ROI apparaisse qui correspond à la périphérie de la fibre. Si une nouvelle analyse des mêmes fibres est nécessaire, enregistrez les retours sur investissement en cliquant sur plus puis enregistrer.
Sélectionnez le canal corporel et ouvrez l’outil de seuil en cliquant sur les onglets image, ajuster et seuil dans la fenêtre principale de Fidji. Dans la fenêtre contextuelle de seuil, définissez les valeurs sur 70 et 255. Sélectionnez ensuite YEN et méthode noir et blanc.
Avant de cliquer sur fond sombre. Enfin, appuyez sur l’onglet Appliquer. Allez dans la fenêtre principale de Fidji et cliquez sur analyser et définir des mesures.
Dans la fenêtre contextuelle, sélectionnez la zone, la fraction de zone et la limite au seuil. Laissez les cases et paramètres restants par défaut. Accédez à la fenêtre ROI et sélectionnez le premier ROI.
Dans la fenêtre principale de Fidji, cliquez sur analyser, puis sur l’outil Analyser les particules. Dans la fenêtre des particules analysées, définissez les valeurs de deux à l’infini et cochez la case pixels. Conservez la valeur de circularité par défaut et sélectionnez Résumer avant de cliquer sur OK.
Pour obtenir les valeurs du centre et de la périphérie de la fibre, répétez la sélection du deuxième et du troisième ROI à chaque fois. Enregistrez ensuite les résultats en cliquant sur fichier, puis enregistrez sous dans la fenêtre récapitulative. Incluez le type de fibre sur le nom du fichier.
Ce protocole immunohistochimique permet la reconnaissance des souris, des fibres oxydatives lentes, comme les types 1 et 2A, des fibres glycolytiques rapides, telles que les types 2X et 2B, et la présence de fibres hybrides. En mesurant la surface et le diamètre minimal de la fibre musculaire, une réduction dépendante de la taille a été appliquée pour obtenir les zones centrales et périphériques de chaque fibre. Les structures remarquables de chaque section musculaire, telles que les brindilles axonales ou les fuseaux musculaires sont de bons repères qui pourraient aider à localiser les mêmes fibres des deux côtés.
Les paramètres décrits pour l’acquisition de la coloration à la laminine corporelle par microscopie confocale. Permis, la visualisation et l’analyse de la taille, du nombre et de la distribution des gouttelettes lipidiques de trois à six fibres simultanément. La méthode a également permis de quantifier trois paramètres importants, à savoir le pourcentage de la surface fibreuse occupée par les gouttelettes lipidiques, la densité et la taille moyenne des gouttelettes lipidiques.
Une mauvaise procédure de congélation et l’incapacité à atteindre la bonne température de l’isopentane ont entraîné la formation d’un cristal de glace à l’intérieur des fibres musculaires. Lorsque les sections n’étaient pas alignées transversalement, la quantification des gouttelettes lipidiques et la comparaison entre les fibres, les muscles ou les animaux n’ont pas pu être effectuées. Le traitement de la deuxième diapositive doit être effectué simultanément avec la première.
Le séchage à l’air de la lame après cryosection pendant 15 minutes réduira considérablement la taille et le nombre de gouttelettes lipidiques. Bodipy peut être utilisé pour étudier l’interaction des gouttelettes lipidiques avec d’autres organites subcellulaires, ou une pile de protéines avec fluorescence d’un spectre différent, ou avec des modèles GFP génétiquement modifiés. La myostéatose a été signalée comme un facteur de mauvais pronostic pour plusieurs maladies.
Par conséquent, cette technique pourrait être utilisée pour surveiller la progression d’une maladie ou pour évaluer l’effet d’un traitement.
