Uma técnica comum para descobrir a função de uma proteína é excluí-la e ver o que acontece. Mas você não pode fazer isso com uma proteína essencial. É essencial, a célula morre.
Então você precisa de uma maneira de remover essa proteína e ter um vislumbre do que acontece pouco antes da morte celular. O esgotamento da proteína deve ser rápido, então você não tem efeitos secundários. Deve ser específico, de modo que só essa proteína é removida e só esgotada quando você quiser que seja.
E não deve afetar a célula de outra forma além de remover essa proteína. Depois de preparar a cepa, use uma cultura durante a noite para determinar qual diluição é necessária. Use essas informações para criar uma nova cultura suficiente com um OD600 entre 0,1 e 0,2, e cultivá-la a 30 graus Celsius.
Em um capô de fumaça, adicione um metanol equivalente a 30 a 50% do volume amostral pretendido a um tubo de 15 mililitros. Feche os tubos firmemente, rotule-os e coloque-os em gelo seco para esfriar. Em seguida, rotule tubos de 1,5 mililitro para armazenamento a longo prazo das amostras e coloque no gelo para esfriar.
Esfrie pelo menos um mililitro de água por amostra no gelo. Uma vez alcançada a densidade óptica alvo para o início da pré-incubação, transfira uma amostra para o tubo pré-preparado contendo metanol frio. Inverta o tubo brevemente e coloque-o de volta no gelo seco.
Esta é a amostra de controle não induzida. Imediatamente, adicione o beta-estradiol de tal forma que a concentração final seja de 10-micromolar. Redemoinho vigorosamente para misturar.
Continue a crescer a cultura como antes, incubando com beta-estradiol para o momento ideal, como descrito no protocolo de texto. O tempo de incubação beta-estradiol é o passo mais importante, e deve ser otimizado para cada proteína. Muito curto e o esgotamento é incompleto e lento.
Muito tempo e os níveis de proteína cairão mesmo antes de você adicionar a auxina. Pipeta até 0,5 microliters de IAA por mililitro de cultura para adicionar mais tarde. Colete uma amostra da cultura não sepleted como descrito anteriormente.
Adicione imediatamente o IAA a uma concentração final de 750 micromolar e redemolar vigorosamente para misturar. Inicie um temporizador o mais rápido possível após a mistura. Coletar amostras de acordo com o projeto experimental.
Em seguida, coloque as amostras no gelo. Certifique-se de que nenhuma das amostras tenha congelado. Se houver, aqueça-os suavemente na mão enquanto inverte constantemente.
Uma vez que todas as amostras são coletadas e não congeladas, centrifuá-las a 3.500 vezes G e quatro graus Celsius por dois minutos. Despeje o metanol e a mistura média e coloque as amostras de volta no gelo. Em seguida, resuspense a pelota celular em um mililitro de água e transfira esta suspensão para um tubo rotulado no gelo.
Centrífuga brevemente a uma velocidade acima de 15.000 vezes G para repelir as células. Depois disso, coloque os tubos de volta no gelo e aspire o líquido. Neste estudo, a degradação é ajustada para alcançar o esgotamento proteico específico e eficiente sem afetar de outra forma o metabolismo da célula de levedura.
As proteínas Prp2 e Prp22 de baixa abundância são esgotadas para menos de 20% após 20 minutos de pré-incubação com beta-estradiol, seguidas por 15 minutos com auxina. Tempos mais longos de pré-incubação levam a um esgotamento mais rápido, mas também mostram esgotamento proteico indesejável antes da adição de auxina. Em comparação, o Dcp1 mais abundante só está esgotado para aproximadamente 30% com o mesmo tratamento.
No entanto, 60 minutos de tempo de pré-incubação resultam em esgotamento para 13% com o mesmo tratamento de auxina ao custo de esgotamento antes que a auxina seja adicionada. Otimize o tempo de pré-incubação e não perca a noção do tempo entre seus pontos de tempo. O que fazer a seguir depende da sua pergunta.
Descobrimos que a amostra de 10 mils da cultura é suficiente para análise de proteína, DNA ou RNA. O procedimento amostral também é facilmente adaptável para ChIP. Agora há uma maneira rápida e específica de esgotar proteínas.
Assim, a função até mesmo de proteínas essenciais pode ser encontrada. O protocolo é bastante seguro. Metanol é o único produto químico perigoso.
Tome cuidado enquanto o dispensa. Faça isso em um capuz de fumaça, e use dois pares de luvas, como o metanol pode passar pela maioria das luvas de nitrito.
