Una tecnica comune per scoprire la funzione di una proteina è eliminarla e vedere cosa succede. Ma non puoi farlo con una proteina essenziale. È essenziale, la cellula muore.
Quindi hai bisogno di un modo per rimuovere quella proteina e dare un'occhiata a ciò che accade poco prima della morte cellulare. L'esaurimento delle proteine dovrebbe essere veloce, quindi non si ottengono effetti secondari. Dovrebbe essere specifico, in modo che solo quella proteina venga rimossa e esaurita solo quando si desidera che sia.
E non dovrebbe influenzare la cellula in nessun altro modo se non rimuovere quella proteina. Dopo aver preparato il ceppo, utilizzare una coltura notturna per determinare quale diluizione è necessaria. Utilizzare queste informazioni per impostare una nuova cultura sufficiente con un OD600 compreso tra 0,1 e 0,2 e aumentarla a 30 gradi Celsius.
In una cappa aspirante aggiungere un metanolo equivalente al 30-50% del volume del campione previsto a un tubo da 15 millilitri. Chiudere saldamente i tubi, etichettarli e metterli sul ghiaccio secco per raffreddare. Successivamente, etichettare i tubi da 1,5 millilitri per lo stoccaggio a lungo termine dei campioni e posizionarsi sul ghiaccio per raffreddare.
Raffreddare almeno un millilitro di acqua per campione sul ghiaccio. Una volta raggiunta la densità ottica bersaglio per l'inizio della pre-incubazione, trasferire un campione nel tubo pre-preparato contenente metanolo freddo. Invertire brevemente il tubo e riposizionare di nuovo sul ghiaccio secco.
Questo è l'esempio di controllo non indotto. Immediatamente, aggiungere il beta-estradiolo in modo che la concentrazione finale sia di 10 micromolare. Ruotare vigorosamente per mescolare.
Continuare a far crescere la cultura come prima, incubando con beta-estradiolo per il tempo ottimale come delineato nel protocollo di testo. Il tempo di incubazione beta-estradiolo è il passo più importante e deve essere ottimizzato per ogni proteina. Troppo breve e l'esaurimento è incompleto e lento.
Troppo a lungo e i livelli proteici diminuiranno anche prima di aver aggiunto l'auxina. Pipetta fino a 0,5 microlitri di AIA per millilitro di coltura da aggiungere in seguito. Raccogliere un campione dalle impostazioni cultura non definite come descritto in precedenza.
Aggiungere immediatamente l'AIA ad una concentrazione finale di 750 micromolare e ruotare vigorosamente per mescolare. Avviare un timer il prima possibile dopo la miscelazione. Raccogliere campioni secondo il progetto sperimentale.
Quindi, metti i campioni sul ghiaccio. Assicurarsi che nessuno dei campioni si sia congelato. Se ce ne sono, scaldarli delicatamente nella mano mentre si inverte costantemente.
Una volta raccolti e non congelati tutti i campioni, centrifugarli a 3,500 volte G e quattro gradi Celsius per due minuti. Versare il metanolo e mescolare mediamente e riposizionare i campioni sul ghiaccio. Quindi, resuspend il pellet cellulare in un millilitro di acqua e trasferire questa sospensione su un tubo etichettato sul ghiaccio.
Centrifugare brevemente ad una velocità superiore a 15.000 volte G per repellere le cellule. Successivamente, riposizionare i tubi sul ghiaccio e aspirare il liquido. In questo studio, la degradazione è ottimizzata per ottenere un esaurimento proteico specifico ed efficiente senza altrimenti influenzare il metabolismo della cellula di lievito.
Le proteine Prp2 e Prp22 spliceosomiche a bassa abbondanza sono entrambe esaurite a meno del 20% dopo 20 minuti di pre-incubazione con beta-estradiolo, seguite da 15 minuti con auxina. Tempi di pre-incubazione più lunghi portano a un impoverimento più rapido, ma mostrano anche un esaurimento proteico indesiderato prima dell'aggiunta di auxina. In confronto, il Dcp1 più abbondante è impoverito solo a circa il 30% con lo stesso trattamento.
Tuttavia, 60 minuti di tempo di pre-incubazione si trae dall'esaurimento al 13% con lo stesso trattamento con auxina a costo di esaurimento prima dell'aggiunta dell'auxina. Ottimizza il tempo di pre-incubazione e non perdere traccia del tempo tra i tuoi punti di tempo. Cosa fare dopo dipende dalla tua domanda.
Abbiamo scoperto che il campione di coltura da 10 mils è sufficiente per l'analisi di proteine, DNA o RNA. La procedura di campionamento è facilmente adattabile anche per il ChIP. Ora c'è un modo rapido e specifico per esaurire le proteine.
Quindi la funzione anche delle proteine essenziali può essere trovata. Il protocollo è abbastanza sicuro. Il metanolo è l'unica sostanza chimica pericolosa.
Fai attenzione mentre lo dispensa. Fallo in un cappuccio di fumi e indossa due paia di guanti, poiché il metanolo può superare la maggior parte dei guanti di nitrile.
