Общий метод, чтобы узнать функцию белка, чтобы удалить его и посмотреть, что происходит. Но вы не можете сделать это с необходимым белком. Это важно, клетка умирает.
Таким образом, вам нужен способ удалить этот белок и мельком увидеть, что происходит незадолго до смерти клетки. Белковое истощение должно быть быстрым, так что вы не получите вторичных эффектов. Она должна быть конкретной, так что только этот белок удаляется и только истощается, когда вы хотите, чтобы это было.
И это не должно влиять на клетку каким-либо другим способом, кроме удаления этого белка. После подготовки штамма используйте ночную культуру, чтобы определить, что такое разбавление. Используйте эту информацию, чтобы создать достаточно новую культуру с OD600 между 0,1 и 0,2, и вырастить его на 30 градусов по Цельсию.
В дымовой капот добавьте метанол, эквивалентный 30-50% от предполагаемого объема образца, в 15-миллилитровую трубку. Закройте трубки плотно, этикетки их, и поместите их на сухой лед, чтобы охладить. Далее наклеить 1,5-миллилитровые трубки для длительного хранения образцов и поместить на лед для охлаждения.
Охладить по крайней мере один миллилитр воды на образец на льду. Как только целевая оптическая плотность для начала предварительной инкубации будет достигнута, перенесите образец в заранее подготовленную трубку, содержащую холодный метанол. Инвертировать трубку кратко и поместить его обратно на сухой лед.
Это неинфицированный контрольный образец. Немедленно добавьте бета-эстрадиол таким образом, чтобы окончательная концентрация была 10-микромоляной. Вихрь энергично смешивать.
Продолжайте развивать культуру, как и прежде, инкубации с бета-эстрадиола для оптимального времени, как указано в текстовом протоколе. Время инкубации бета-эстрадиола является наиболее важным шагом и должно быть оптимизировано для каждого белка. Слишком коротка и истощение является неполным и медленным.
Слишком долго, и уровень белка упадет еще до того, как вы добавили auxin. Pipette до 0,5 микролитров IAA на миллилитр культуры, чтобы добавить позже. Соберите образец из неописуемой культуры, как описано ранее.
Немедленно добавьте IAA к окончательной концентрации 750-micromolar и вихрь энергично смешивать. Запустите таймер как можно скорее после смешивания. Сбор образцов в соответствии с экспериментальным дизайном.
Затем поместите образцы на лед. Убедитесь, что ни один из образцов не замерз. Если таковые имеются, осторожно нагревайте их в руке, постоянно инвертирование.
После того, как все образцы собраны и не заморожены, центрифуга их на 3500 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение двух минут. Слейте метанол и средней смеси и поместите образцы обратно на лед. Затем повторно посвять клеточные гранулы в один миллилитр воды и перенесите эту подвеску в помеченную трубку на льду.
Центрифуга ненадолго на скорости более 15 000 раз G, чтобы отталкивать клетки. После этого поместите трубки обратно на лед и аспирировать жидкость. В этом исследовании, деградация настроена для достижения конкретных и эффективных истощения белка, не влияя иным образом на метаболизм дрожжевой клетки.
Белки с низким содержанием сплайзоомаля Prp2 и Prp22 истощаются до менее чем 20% после 20 минут предварительной инкубации бета-эстрадиолом, а затем 15 минут с ауксином. Более длительное время предварительной инкубации приводит к более быстрому истощению, но также показывает нежелательное истощение белка до добавления auxin. Для сравнения, более обильные Dcp1 только исчерпаны примерно до 30% с тем же лечением.
Тем не менее, 60 минут времени до инкубации приводит к истощению до 13% с той же обработки auxin за счет истощения до добавления auxin. Оптимизируйте время предварительной инкубации и не теряйте время между точками времени. Что делать дальше, зависит от вашего вопроса.
Мы обнаружили, что 10-мильной выборки культуры достаточно для анализа белка, ДНК или РНК. Процедура отбора проб также легко адаптируется для ChIP. Теперь есть быстрый и специфический способ истощения белков.
Таким образом, функция даже основных белков может быть найдена. Протокол достаточно безопасен. Метанол является единственным опасным химическим веществом.
Позаботьтесь при его раздаче. Сделайте это в дымовой капот, и носить две пары перчаток, как метанол может пройти через большинство нитрил перчатки.
