调整降解以实现特定和高效的蛋白质消耗

找出蛋白质功能的一个常见技术是删除它，看看会发生什么。但是你不能用必需的蛋白质来做到这一点。这一点至关重要，细胞死亡。

所以你需要一种方法来去除这种蛋白质，并瞥见细胞死亡前发生的事情。蛋白质消耗应该很快，所以你没有得到二次效应。它应该是具体的，所以只有蛋白质被移除，只有在你想要的时候才耗尽。

它不应该影响细胞在任何其他方式，除了去除蛋白质。准备应变后，使用隔夜培养确定需要什么稀释。使用此信息可以设置一个在 0.1 和 0.2 之间的 OD600 足够的新区域性，并在 30 摄氏度下增长。

在烟罩中，将相当于预期样品体积30%至50%的甲醇添加到15毫升管中。紧闭管子，贴上标签，放在干冰上冷却。接下来，标记1.5毫升管，用于长期储存样品，并放在冰上冷却。

在冰上冷却每个样品至少一毫升的水。达到预孵育开始的目标光学密度后，将样品转移到含有冷甲醇的预制备管中。短暂地反转管子，放回干冰上。

这是未引推的控制样本。立即添加β-雌二醇，使最终浓度为10微摩尔。旋转大力混合。

继续像以前一样发展培养文化，使用β-雌二醇孵育，以获得最佳时间，如文本协议中所述。β-雌二醇孵育时间是最重要的一步，必须针对每个蛋白质进行优化。太短，耗竭是不完整的和缓慢的。

时间过长，蛋白质水平会下降，甚至在你加入奥辛之前。每毫升培养量增加 0.5 微升 IAA，稍后再添加。从前面描述的未消耗区域性中收集样本。

立即将 IAA 添加到 750 微摩尔的最终浓度中，并大力旋转混合。混合后尽快启动计时器。根据实验设计采集样品。

然后，将样品放在冰上。确保样本没有冻结。如果有，轻轻温暖他们的手，同时不断倒。

一旦所有样品被收集并未冷冻，在3，500倍G和4摄氏度的离心机两分钟。从甲醇和介质混合中倒掉，将样品放回冰上。然后，将细胞颗粒重新悬浮在一毫升水中，然后将悬浮液转移到冰上标记的管子上。

以超过15，000倍G的速度短暂离心，以击退细胞。在此之后，将管子放回冰上，吸气。在这项研究中，降解被调整，以实现具体和有效的蛋白质耗尽，而不影响酵母细胞的新陈代谢。

低丰度拼接Prp2和Prp22蛋白在用β-雌二醇预孵育20分钟后，均耗尽到20%以下，随后用奥辛15分钟。更长的预孵化时间导致更快的耗竭，但也显示在添加奥辛之前不良的蛋白质耗竭。相比之下，更丰富的Dcp1只耗尽到约30%与相同的治疗。

然而，60分钟的预孵化时间导致消耗到13%与相同的奥辛治疗，在添加奥辛之前消耗成本。优化预孵化时间，不要在时间点之间失去时间跟踪。下一步做什么取决于你的问题。

我们发现，10密耳培养的样本足以用于蛋白质、DNA或RNA分析。采样程序也很容易适应 ChIP。现在有一种快速而具体的方式来消耗蛋白质。

因此，即使是必需蛋白质的功能也被发现。该协议相当安全。甲醇是唯一危险的化学物质。

分配时小心。在烟罩中做，戴两副手套，因为甲醇可以穿过大多数硝酸盐手套。