Ce protocole microscopique d’expansion permet à l’investigateur de visualiser des protéines glomerular avec la résolution nanométrique sur un microscope conventionnel. Le principal avantage de la microscopie d’expansion est qu’elle est accessible à une vaste communauté de recherche. Commencez par faire des espaceurs pour la chambre de gelation.
La couverture en verre numéro un et numéro 1,5 se glisse en cinq bandes millimétriques, à l’aide d’un couteau à diamants. Placez une glissade de verre dans une chambre de coloration et placez les bandes de glissement de couverture numéro 1,5 sur la glissière de verre, de sorte qu’elles forment un carré de 2,5 centimètres. Pipette une gouttelette d’eau distillée double dans les coins de la place pour adhérer à la couverture de verre glisser rayures les uns aux autres et à la glissade en verre.
Attendez environ 20 minutes pour que les feuillets de couverture numéro 1.5 soient bien fixés. Pipette une gouttelette d’eau sur chaque numéro 1.5 bande de glissement de couverture. Placez quatre bandes de glissement de couverture en verre numéro un sur les feuillets de couverture numéro 1.5.
Pour le couvercle de la chambre de gelation, envelopper un verre de couverture avec du film de paraffine, en évitant les plis ou la saleté sur le film. Pour le traitement d’ancrage, retirez le PBS des cellules vitrées immunitaires et ajoutez 250 microlitres de tampon d’ancrage par puits directement sur le glissement du couvercle en verre. Incuber la plaque pendant trois heures à température ambiante.
Gardez le substrat dans l’obscurité à l’aide d’une boîte. Après l’incubation, retirer le tampon d’ancrage et laver le glissement du couvercle une fois avec 1,5 millilitres de PBS par puits. Pour tacher les fibres d’actine, décongelez une solution de phalloidine compatible EXM et incubez-la pendant 45 minutes à température ambiante.
Pendant ce temps, dissoudre l’acrylate de sodium dans de l’eau distillée double à l’aide d’un dispositif d’agitation et préparer la solution monomère sur la glace. Retirer la phalloidine des cellules et les laver avec 1,5 millilitres de PBS, deux fois, à température ambiante. Laissez 1,5 millilitre de PBS dans le puits après le dernier lavage.
Utilisez des forceps et une canule pour soulever le glissement de verre de couverture de la plaque de six puits et placez-le dans la chambre de gelation. Ajouter aps à la solution de gelling et vortex brièvement. Pipette 200 microlitres de solution de gelling sur l’échantillon et fermer prudemment la chambre, en évitant les bulles d’air dans le gel.
Ajouter de l’eau à la chambre de coloration, et incuber la chambre de coloration pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius pour polymériser le gel. Sortez la chambre de coloration de l’incubateur. Pour ouvrir le couvercle de la chambre de gelation, introduire une lame de rasoir entre le couvercle et l’espaceur, et retirer le couvercle avec prudence.
Retirez les entretaires avec la lame de rasoir et coupez tout gel supplémentaire. Utilisez un pinceau pour détacher les bords du gel. Mettre la diapositive avec le gel et couvrir le verre dans un plat rempli de PBS.
Retirez ensuite le verre détaché du gel en le secouant doucement. Placez la lame sous le gel pour fixer le gel à la lame. Avec le gel sur la lame, diviser le gel en petits morceaux à l’aide de la lame de rasoir.
Poussez doucement un morceau de gel dans un puits d’une plaque de six puits avec un fond de verre et dépliez-le avec un pinceau. Utilisez le pinceau pour garder le gel hydraté avec une petite quantité de PBS. À l’aide d’un microscope inversé, prenez des images d’aperçu avec une faible ouverture numérique pour les images de pré-expansion.
Diluer proteinase K à quatre unités par millilitre dans le tampon de digestion pour faire la solution de digestion. Ajouter 500 microlitres de la solution de digestion à chaque puits, et plonger le gel dans la solution. Laissez-le digérer toute la nuit à température ambiante avec le couvercle fermé pour garder les échantillons dans l’obscurité.
Retirer la solution de digestion à l’aide d’une pipette et la jeter. Ajouter un millilitre d’eau distillée double et incuber le gel immergé pendant 10 minutes à température ambiante. Retirer l’eau et ajouter un millilitre d’eau fraîche distillée double.
Continuer à échanger de l’eau toutes les 10 minutes jusqu’à ce qu’un plateau d’expansion soit atteint, ce qui provoque le gel à devenir optiquement clair. Retirer l’eau du gel et commencer immédiatement la microscopie. À l’aide d’un microscope inversé, utilisez un objectif d’air à faible grossissement pour trouver des cellules dans l’état de pré-expansion.
Passez aux objectifs 40 X et 63 X pour une meilleure résolution. Excitez avec la longueur d’onde de l’intérêt et de prendre l’image via la caméra. Ce protocole EXM permet une expansion jusqu’à quatre fois.
Pour déterminer le facteur d’expansion, il est essentiel d’imager les cellules avant et après l’expansion. Un ancrage et une homogénéisation insuffisants peuvent entraîner des distorsions et des ruptures de cellules. Des exemples représentatifs de cellules rompues sont montrés ici.
Cette méthode peut être utilisée pour étudier la colocalisation de la F-actine et des protéines adaptateurs d’actine, telles que la podocine et la néphrine. Podocin est représenté en vert, actine en bleu et néphrine en rouge. Les zones blanches indiquent la colocalisation.
L’intensité et l’abondance du signal fluorescent sont essentielles au succès de l’EXM. L’ancrage efficace des colorants fluorescents via ACX est d’une importance cruciale pour ce protocole. Dans nos mains solubilized ACX est bon pour un jusqu’à trois à quatre mois.
