Les organoïdes humains dérivés de patients sont des systèmes modèles in vitro tridimensionnels qui représentent à la fois la diversité des patients et l’hétérogénéité cellulaire des tumeurs. Ce protocole et cette démonstration vidéo fournissent un guide détaillé et pratique pour établir une tumeur du sein dérivée du patient et des organoïdes normaux. Les organoïdes tumoraux mammaires dérivés de patientes sont de nouveaux modèles passionnants, mais difficiles à établir.
Le protocole complet que nous fournissons ici devrait aider à préparer les chercheurs qui tentent de développer des organoïdes mammaires et à les familiariser avec les défis attendus. Chaque lignée d’AOP dérivée d’un patient différent est unique en termes de morphologie et de taux de croissance. Contrairement à deux systèmes de lignées cellulaires 2D, les organoïdes se développent mieux lorsqu’ils sont plaqués à une densité élevée, ce qui permet de meilleures interactions intercellulaires.
La démonstration de la procédure sera Disha Aggarwal, une étudiante diplômée de mon laboratoire. Pour commencer, décongelez une bouteille de matrice membranaire basale sur de la glace ou pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Transférer le tissu réséqué dans une boîte de Petri stérile de 10 centimètres.
Examinez le tissu macroscopiquement et notez s’il semble morphologiquement gras, vascularisé ou nécrotique. De plus, notez la taille et la forme du tissu et prenez une photo du tissu avec une règle en vue. Hacher le tissu en petits morceaux avec un scalpel stérile numéro 10 et le transférer dans un tube conique de 50 millilitres.
Ajouter 10 millilitres de solution IV de collagénase de deux milligrammes par millilitre et sceller le tube. Placez le tube sur un agitateur orbital à 37 degrés Celsius à 140 tr / min pendant 30 à 90 minutes à un angle de 30 degrés. Pendant l’incubation, placer une partie aliquote de milieu complet à préchauffer à 37 degrés Celsius dans une perle ou un bain-marie.
Toutes les 15 minutes, remettre le tissu en suspension en mélangeant vigoureusement de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique pré-enduite stérile de cinq millilitres. Dissociation surveillée au fil du temps en observant le tube au microscope à un grossissement de 5X ou plus. Une fois le tissu dissocié, centrifuger à 400 G pendant cinq minutes, aspirer le surnageant et ajouter 10 millilitres d’AdDF + Encore une fois, centrifuger et aspirer soigneusement le surnageant, car les granulés de tissu peuvent parfois être lâches.
Si la pastille de tissu est partiellement rouge, ajoutez deux millilitres de tampon de lyse des globules rouges et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après l’incubation, ajouter 10 millilitres d’AdDF+ dans le tube, centrifuger à 400 G pendant cinq minutes et jeter le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 50 à 300 microlitres de matrice membranaire basale froide non diluée et mélangez-la soigneusement par pipetage pour éviter de former des bulles.
À l’aide d’une plaque de culture tissulaire à six puits qui est préchauffée dans l’incubateur pendant la nuit, plaquez 300 microlitres de dôme à matrice membranaire basale contenant des organoïdes dans chaque puits. Laissez la plaque intacte dans le capot pendant cinq minutes avant de la placer à 37 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes pour que le dôme à matrice membranaire basale se solidifie complètement. À la fin de l’incubation, ajouter trois millilitres de milieu complet préchauffé goutte à goutte à chaque puits et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Après l’incubation, capturez des images des organoïdes à l’aide d’un objectif 5X sur un microscope à fond clair inversé. Soulevez le dôme de matrice membranaire du socle dans le milieu du puits à l’aide d’un grattoir de cellule ou d’une pointe de pipette d’un millilitre. À l’aide d’une pointe de pipette pré-revêtue, transférer le dôme flottant des organoïdes avec un tube conique de 15 ou 50 millilitres, selon le nombre de puits récoltés.
Ajoutez ensuite DPBS pour augmenter le volume à au moins cinq millilitres. Faites tourner les tubes à 400 G pendant cinq minutes. La matrice membranaire basale avec organoïdes forme une couche au fond.
Après avoir aspiré le surnageant, ajoutez 5 à 20 millilitres de DPBS, selon le nombre de puits regroupés dans un tube. Mélanger la pastille organoïde de membrane basale dans le SPBD à l’aide d’une pipette jetable stérile pré-revêtue. Encore une fois, centrifugez et jetez le surnageant.
À l’aide d’une pointe de pipette revêtue, ajouter un réactif de dissociation cellulaire à trois fois le volume de la matrice membranaire basale et remettre les organoïdes en suspension. Placez le tube sur un agitateur orbital à 37 degrés Celsius à 140 tr / min pendant 8 à 15 minutes en position inclinée. Surveillez le tube en l’observant au microscope toutes les cinq minutes pour vous assurer que les organoïdes sont divisés en grappes plus petites.
Ajouter AdDF+ à un volume égal ou supérieur au réactif de dissociation cellulaire et pipette pour mélanger les organoïdes. Faire tourner à 400 G pendant cinq minutes pour obtenir une pastille organoïde. Une fois qu’une pastille organoïde blanche sans matrice membranaire basale non dissoute est obtenue, jeter le surnageant et remettre en suspension le granulé dans un millilitre d’AdDF + Porter le volume à 10 millilitres avec AdDF + Faire tourner le tube pour l’étape de lavage et jeter le surnageant.
Ajouter la quantité requise de matrice membranaire basale aux organoïdes digérés en fonction du rapport de division approprié. Mélanger en pipitant doucement de haut en bas pour éviter de créer des bulles et placer immédiatement sur la glace. Dômes d’organoïdes de 300 microlitres en plaques remises en suspension dans une matrice membranaire basale dans une plaque préchauffée à six puits.
Laissez la plaque intacte dans le capot pendant cinq minutes avant de la placer à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 20 à 30 minutes pour que les dômes se solidifient. À la fin de l’incubation, trois millilitres de milieu complet préchauffé à chaque puits et replacer la plaque dans l’incubateur. Ajouter le milieu complet frais tous les cinq à sept jours.
Les différentes lignées organoïdes de tumeurs mammaires dérivées du patient diffèrent par leur morphologie et leur taux de croissance. Les organoïdes mammaires normaux et les quelques carcinomes canalaires précoces dans les organoïdes dérivés de C2 ressemblaient à la structure mammaire normale, avec une lumière centrale entourée de cellules canalaires. Les organoïdes dérivés du carcinome lobulaire invasif ont tendance à former des structures lâches en forme de grappes de raisin.
Pendant ce temps, les organoïdes dérivés de carcinomes canalaires invasifs ont tendance à former des organoïdes denses, grands et ronds. La croissance des organoïdes a été mesurée à l’aide d’un test de viabilité cellulaire luminescente aux jours trois, six, neuf et 12, avec une lecture de base le premier jour après le placage. Les images en champ clair des mêmes organoïdes élargis au fil du temps sont montrées ici.
Certaines lignées organoïdes dérivées de patients ont un temps de doublement de deux jours, tandis que d’autres prennent cinq jours. Il est important d’être patient avec des lignées organoïdes particulières qui sont lentes à établir. D’après notre expérience, l’augmentation de la densité de placage ou le filtrage des débris favorise la croissance des AOP.
Les organoïdes dérivés de patients, ou AOP, sont d’excellents modèles pour le dépistage de médicaments. Ils modélisent les interactions cellule-cellule ainsi que cellule-matrice extracellulaire qui sont essentielles à l’étude de la physiopathologie du cancer. De plus, les AOP peuvent subir des manipulations génétiques et peuvent être utilisées pour développer des xénogreffes dans des systèmes de co-culture, ce qui en fait d’excellents modèles pour les études mécanistes.
