Cette méthodologie combine l’amélioration du protocole de dégagement avec la capacité oculaire de sectionnement optique de la technologie Mesos PIM nous permettant d’effectuer des reconstructions mésoscopiques à résolution micrométrique. Il offre la possibilité d’imager des tissus cardiaques massifs ou des cœurs entiers de souris en une seule analyse sans perdre l’organisation tissulaire tridimensionnelle d’origine. Une fois que le cœur a été canulé par l’aorte proximale lavée dans une solution tyro et fixée dans de l’aldéhyde paraforme à 4% dans du PBS 0,01 molaire, il est prêt à commencer le protocole de nettoyage.
Lavez le cœur trois fois dans 0,01 molaire PBS à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Après cette étape, le cœur peut être stocké dans du PBS et de l’azoture de sodium à 0,01% à quatre degrés Celsius pendant plusieurs mois. Incuber le cœur dans 20 millilitres de solution d’hydrogel en état d’agitation à 15 RPM pendant trois jours à quatre degrés Celsius.
Dégazer l’échantillon à température ambiante à l’aide d’un sécheur, d’une pompe à vide et d’un système de tubes qui relie le sécheur à la bande de pompe et au pipeline d’azote. Placez l’échantillon dans le séchoir et ouvrez le flacon en gardant le capuchon dessus. Fermez le séchoir et retirez l’oxygène du tube en ouvrant la canalisation d’azote.
Allumez la pompe à vide pour retirer l’oxygène de la sécheuse pendant 10 minutes. Éteignez la pompe et ouvrez le bouton de la sécheuse jusqu’à la canalisation d’azote. Ouvrez ensuite le robinet d’azote.
Une fois que la pression est égale à la pression atmosphérique, ouvrez soigneusement le séchoir et fermez rapidement le flacon. Gardez le cœur dans la solution d’hydrogel dégazée à 37 degrés Celsius pendant environ trois heures au repos. Lorsque l’hydrogel est correctement polymérisé et semble entièrement gélatineux, retirez-en soigneusement le cœur et placez-le dans une solution de clairance dans le flacon avec solution de clairage.
Changez la solution de nettoyage dans le flacon une fois tous les trois jours pour accélérer la procédure de clarification. Une fois que le cœur semble complètement clarifié, retirez-le du flacon et lavez-le dans 50 millilitres de PBS réchauffé pendant 24 heures en état de tremblement. Laver à nouveau dans 50 millilitres d’un X PBS T pendant 24 heures en état d’agitation.
Incuber l’échantillon dans 0,01 milligrammes par millilitres de germe de blé aglutinine Alexa plancher 633 dans trois millilitres d’un X PBS T en état d’agitation à 50 RPM à température ambiante pendant sept jours. Après l’incubation de sept jours, laver l’échantillon dans 50 millilitres d’un X PBS T à température ambiante en agitant pendant 24 heures. Incuber l’échantillon dans 4% PFA pendant 15 minutes, puis le laver trois fois dans 0,01 molaire PBS pendant cinq minutes chacun.
Incuber le cœur successivement dans 20 et 47% de TDE dans 0,01 molaire PBS pendant huit heures chacun. Et enfin à 68%TDE dans 0,01 molaire PBS pour fournir l’indice de réfraction requis de 1,46. Remplissez doucement environ 80% de la couvette de quartz externe avec le milieu d’indice de réfraction.
Remplissez le quvet de quartz interne avec le même milieu d’indice de réfraction. Immergez l’échantillon dans le quvet interne. Déplacez doucement l’échantillon vers le bas de la pince à épiler à l’aide d’une fine pince à épiler et disposez le cœur avec son axe longitudinal parallèle à l’axe principal du quvet pour minimiser le trajet de la lumière d’excitation à travers le tissu pendant le balayage.
Fixez soigneusement la fiche sur mesure au-dessus de la quvet interne avec deux vis. Montez l’échantillon sur l’étage du microscope à l’aide d’aimants. Traduisez manuellement l’étape d’échantillonnage verticale pour immerger le quet interne dans le quet externe.
Allumez la source lumineuse d’excitation avec une longueur d’onde de 638 nanomètres et réglez-la à faible puissance de l’ordre de trois milliwatts. Déplacez l’échantillon à l’aide du traducteur motorisé pour éclairer une plaque interne du tissu. Allumez le logiciel de la caméra en direct de l’image HC et réglez le déclencheur de la caméra sur le mode feuille de lumière du déclencheur de bord externe pour piloter le déclencheur d’acquisition de la caméra par le logiciel personnalisé contrôlant l’ensemble de la configuration.
Activez l’enregistrement automatique dans le logiciel de l’appareil photo et définissez le dossier de sortie dans lequel les images doivent être enregistrées. Ajustez manuellement la position de l’échantillon dans le plan X Y avec les traducteurs linéaires pour déplacer l’échantillon vers le centre du champ de vision du capteur de la caméra. Déplacez l’échantillon le long de l’axe Z à l’aide du traducteur motorisé linéaire pour identifier les bordures cardiaques pour la reconstruction tomographique.
Augmentez la puissance laser à environ 20 milliwatts avant de commencer la séance d’imagerie. Démarrez l’acquisition tomographique en cliquant sur le bouton de démarrage dans le panneau de capture du logiciel d’imagerie, et en même temps commencez à déplacer l’échantillon le long de l’axe Z à la vitesse constante de six micromètres par seconde à l’aide du traducteur motorisé. La combinaison de la méthodologie de clarté avec le TDE comme milieu d’indice de réfraction ne modifie pas de manière significative le volume final de l’échantillon et n’entraîne pas de déformation isotrope de l’échantillon.
L’optique d’excitation a produit une feuille de lumière avec un minimum de déchets d’environ six micromètres qui ont divergé jusqu’à 175 micromètres au bord du champ de vision. La synchronisation de l’obturateur roulant de la caméra avec le balayage axial des déchets de la feuille lumineuse a permis de collecter le signal d’émission uniquement dans la partie échantillon excitée par les déchets de la feuille lumineuse, ce qui a donné une moyenne de F W H M d’environ 6,7 micromètres sur tout le champ de vision. La fonction d’étalement du point Z du microscope a également été estimée par une reconstruction tomographique de la nanosphère fluorescente et un F W H M de 6,4 micromètres a été estimé par l’ajustement.
La capacité du système à résoudre des membranes cellulaires uniques en trois dimensions avec un rapport signal sur bruit suffisant dans l’ensemble de l’organe a également été confirmée. La procédure de dégazage est l’étape la plus critique du protocole. Si elle n’est pas effectuée correctement, le tissu pourrait subir des dommages indiquant pendant l’incubation dans une solution de nettoyage.
Le protocole présenté peut être combiné avec un protocole de coloration multiple pour réaliser une reconstruction d’organe entier intégrant différentes structures biologiques et peut être appliqué à l’étude de modèles pathologiques.
