Pour les maladies néonatales telles que la cardiomyopathie, la thérapie régénérative utilisant des cellules souches pluripotentes induites a un potentiel énorme. Cependant, la croissance accélérée in vitro de cellules mène aux dommages d’ADN par les métabolites accumulés tels que les espèces réactives d’oxygène. La transplantation de ces cellules endommagées par l’ADN entraînerait un mauvais engraftment et une régénération de l’organe.
Avant la transplantation, la qualité des cellules doit être évaluée. Ici, nous fournissons deux protocoles étape par étape pour évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules souches. Jessica Miller, chercheuse, Nikhil Mardhekar, chercheur, et Vasanthi Rajasekaran, technicienne de laboratoire, démontreront les procédures.
Pour commencer, placez 500 milligrammes d’agarose à faible fonte dans 100 millilitres d’eau libre d’ADN-ARN. Chauffer la bouteille au four à micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve. Ensuite, placez la bouteille dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire.
Pour préparer des diapositives de comète pré-enduites, placez quelques gouttes de 0,5 % sur une glissière en verre. Étendre immédiatement l’agarose pour former une fine couche de revêtement agarose à l’aide d’un coverslip. Travaillant dans des conditions de faible lumière pour éviter les dommages cellulaires induits par la lumière ultraviolette, mélangez 10 microlitres de suspension cellulaire et 90 microlitres de solution d’agarose dans un tube.
Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pour empêcher l’agarose de se solidifier. Mélanger la solution sans introduire de bulles d’air, et pipette 70 microlitres par tache sur la glissière de comète pré-enduite. À l’aide d’une pointe de pipette, étendre le mélange d’agarose cellulaire pour former une fine couche.
Placez la glissade à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Dans un récipient, submergez complètement la lame dans un tampon de lyse froide. Placez le récipient dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant une heure.
Remplacez le tampon de lyse par une solution alcaline froide. Assurez-vous que les glissières sont complètement submergées. Après avoir laissé le récipient dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant encore 30 minutes, placez la lame dans un réservoir horizontal d’électrophoresis.
Remplissez le réservoir d’électrophoresis alcalin froid jusqu’à ce que les glissières soient complètement submergées. Appliquer la tension à un volt par centimètre pendant 15 à 30 minutes. Dans un récipient, submerger complètement la lame dans de l’eau déionisée froide.
Après deux minutes, retirer l’eau déionisée et ajouter l’eau déionisée fraîche, puis répéter cette étape une deuxième fois. Ensuite, remplacez l’eau déionisée par de l’éthanol froid à 70 %. Après cinq minutes, retirer délicatement la lame sans l’incliner et la laisser sécher à l’air libre.
Une fois séché, ajouter 100 microlitres de colorant d’ADN dilué à chaque endroit, et attendre 15 minutes à température ambiante. À l’aide d’un filtre FITC au microscope à épifluorescence, prendre des images de 50 à 100 comètes au total par échantillon. Cardiomyocytes iPS-dérivés de culture tels que décrits dans le protocole de texte.
Pour voir les cardiomyocytes dérivés de l’iPS dans les diapositives de chambre, jetez d’abord le milieu de culture des puits, et lavez les cellules trois fois avec PBS. Ajouter un millilitre de 0,25% trypsine par puits, et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vérifiez la plaque au microscope pour le détachement cellulaire.
Ajouter ensuite un millilitre de CMM pour arrêter la Trypsine. Placez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et 200 fois g. Jetez le milieu, ajoutez un millilitre de CMM et résépendez les cellules.
Comptez les cellules et ajustez le nombre de cellules pour obtenir deux millions de cellules dans 1,6 millilitres de CMM. Maintenant, les graines 200 microlitres de suspension cellulaire par puits de la diapositive de chambre de huit puits. Appuyez doucement sur la glissière pour étendre les cellules autour du puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius. Pour le traitement de doxorubicine de cardiomyocyte iPS-dérivé, jetez le milieu de culture des puits de cardiomyocyte iPS-dérivés, et lavez les cellules avec PBS. Traiter les cellules avec de la doxorubicine d’un micromolaire pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.
Aspirer le milieu, et laver les cellules avec PBS. Pour effectuer l’immunolabeling, lavez les cellules trois fois avec PBS et ajoutez 200 microlitres de paraformaldéhyde fraîchement préparé à chaque puits. Fixer les cellules pendant 20 minutes dans l’obscurité à température ambiante.
Après avoir lavé les cellules avec PBS, ajouter 200 microlitres de tampon de blocage par puits, et bloquer pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée à température ambiante. Retirez le tampon de blocage et ajoutez 200 microlitres de solution d’anticorps primaire. Après avoir couvé pendant 45 minutes dans une chambre sombre humidifiée à température ambiante, lavez les puits trois fois avec du PBS.
Retirer le PBS et ajouter 200 microlitres de mélange secondaire d’anticorps. Incuber pendant 45 minutes dans une chambre sombre humidifiée à température ambiante. Ensuite, lavez les puits trois fois avec PBS.
Laver à l’eau déionisée avant de monter les toboggans à l’antifade. Placez un verre de couverture et rangez les glissières dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un microscope confocal, prenez trois à cinq images de champs aléatoires par échantillon et procédez à l’analyse d’images.
Pour compter les foyers de réponse aux dommages à l’ADN, téléchargez et installez CellProfiler. Sélectionnez fichier, importation, pipeline à partir du fichier, et choisissez le fichier pipeline nommé perncti gamma-H2AX. Faites glisser et déposer le dossier contenant les images acquises des foyers gamma-H2AX à la fenêtre de liste de fichiers dans la section images des modules d’entrée pour analyse.
Suivez ensuite les instructions indiquées dans le protocole texte. Pour définir les paramètres des images, faites glisser l’image désirée pour analyse sur la liste des fichiers. Sous modules d’entrée, sélectionnez des images.
Également dans les modules d’entrée, sélectionnez les métadonnées, puis sélectionnez les noms et les types. Pour les groupes, sélectionnez non. En travaillant dans des modules d’analyse, sélectionnez couleur à gris.
Sélectionnez ensuite lisse, sélectionnez identifier les objets primaires, et sélectionnez à nouveau lisse. Sélectionnez ensuite améliorer ou supprimer les fonctionnalités, puis sélectionnez identifier les objets primaires. Toujours en cours de travail dans les modules d’analyse, sélectionnez relier des objets, puis classer les objets, et enfin sélectionner l’exportation vers la feuille de calcul.
Cliquez sur analyser les images en bas à gauche pour effectuer l’analyse d’image. À la fin de l’analyse, plusieurs images sont générées. Notez le fichier CSV qui est généré et enregistré à l’emplacement approprié sur l’ordinateur.
Ce fichier contient les données quantitatives pour une analyse plus approfondie. Dans la feuille de calcul appelée mon image d’expérience, la colonne B aura le nombre de noyaux qui ont jusqu’à cinq ponctions, et la colonne D aura le nombre de noyaux qui ont plus de cinq ponctions. Ajouter les colonnes B et D pour obtenir le nombre total de noyaux.
Répétez ces étapes pour toutes les images, en changeant le nom de fichier de mon expérience avant chaque analyse. Des micrographes représentatifs de comètes provenant de cellules iPS traitées au doxo et non traitées sont présentés ici. Une quantité basale de dommages d’ADN a été trouvée dans les cellules d’iPS, exprimées comme une fraction des dommages d’ADN et du moment de queue.
Cependant, le traitement doxo a augmenté les dommages à l’ADN dans les cellules iPS comme prévu, ce qui indique que l’essai de comète peut être utilisé pour évaluer l’intégrité de l’ADN dans les cellules souches pluripotentes. Des micrographes représentatifs de l’immunolabeling gamma-H2AX sont montrés ici, au grossissement inférieur et au grossissement plus élevé. Dans les cardiomyocytes iPS-dérivés de contrôle, plus de 90% des cellules ont eu moins de cinq foyers de DDR par noyaux.
Et un total de moins de 10% des cellules avaient plus de six foyers DDR par noyaux. Pour les cardiomyocytes dérivés de l’iPS cultivés pendant six mois, moins de 90% des cellules avaient jusqu’à cinq foyers DDR par noyaux, et un total de plus de 13% des cellules avaient plus de six foyers DDR par noyaux. Alors que dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPS traités par doxo, moins de 80% des cellules avaient jusqu’à cinq foyers DDR par noyaux.
Et un total d’environ 24% des cellules avaient plus de six foyers DDR par noyaux. Ces données indiquent que la culture prolongée des cellules cardiomyocytes dérivées de l’iPS et le traitement doxo ont causé des dommages significatifs à l’ADN, les rendant inadaptés à la transplantation cellulaire. Il est très important d’éviter les variables tout en mélangeant la suspension cellulaire, car cela pourrait affecter l’électrophoresis.
Après cette procédure, vous pouvez effectuer les analyses de comète et les procédures d’immunolabeling avec des cellules de différents types. Ces techniques permettront d’évaluer les cellules de toutes sortes pour les dommages causés par l’ADN avant d’être utilisées dans des études de transplantation cellulaire.
