Ce protocole peut aider à maintenir la stabilité de la cargaison, qui peut être à la fois de petites molécules et des protéines, grâce à l’utilisation du polybubble, qui peut à son tour réduire les interactions de carbone avec le solvant. Cette nouvelle technique peut être utilisée pour améliorer la couverture vaccinale dans les pays en développement, car les fonctionnalités vaccinals peuvent souvent être compromises en raison de l’inefficacité des installations de transport et de stockage. Pour fabriquer les polybubbles, utilisez d’abord une pipette de transfert d’un millilitre pour ajouter 800 microlitres de 10% CMC dans un flacon de verre de 0,92 millilitre.
Pour synthétiser pclta, mélanger 1000 grammes par millilitre de 14 kilodalton PCL dans 200 microlitres de DCM. Pour synthétiser plgada, mélanger 1000 grammes par millilitre de cinq kilodalton PLGADA en 200 microlitres de chloroforme. Mélanger le photoinitiateur avec le mélange de polymère d’intérêt à un rapport de 0,005 à 1 et charger 200 microlitres de la solution résultante en une seringue en verre d’un millilitre montée sur une pompe à seringues reliée à un tube d’acier inoxydable de distribution d’un diamètre intérieur de 0,016 pouce.
À l’aide d’un micro moteur pour contrôler le mouvement avant et arrière du tube polymère, injecter le polymère dans le flacon de verre à 10 %CMC pour former les polybubbles et guérir les polybubbles sous la lumière ultraviolette à une longueur d’onde de 254 nanomètres pendant 60 secondes à deux watts par centimètre carré, puis congeler les polybubbles dans l’azote liquide pendant 30 secondes et lyophiliser les porteurs pendant la nuit à 0,01 millibar vide en moins 85 degrés Celsius. Pour le centrage de la cargaison d’intérêt dans un polybubble, mélanger la cargaison avec 5% CMC dans un rotateur pendant la nuit pour augmenter la viscosité de la cargaison avant d’injecter manuellement deux microlitres du mélange de cargaison dans le polybubble. Lorsque toute la cargaison a été injectée, re-guérir, gel flash, et lyophiliser le polybubble injecté comme vient de le démontrer.
Le lendemain matin, utilisez des forceps pour séparer le polybubble du CMC séché et laver le polybubble avec de l’eau déionisée pour éliminer tout CMC résiduel. Ensuite, coupez le polybubble en deux et imagez les moitiés par microscopie confoccale pour s’assurer que la cargaison est centrée. Pour la libération de petites molécules, incuber les polybubbles avec de l’acriflavine centrée dans 400 microlitres de PBS à 37 degrés Celsius pour la longueur d’incubation appropriée.
À chaque moment expérimental, recueillir le supernatant et ajouter 400 microlitres de PBS frais au flacon. Ensuite, utilisez un lecteur de plaque pour quantifier l’intensité de fluorescence du supernatant recueilli. Pour l’activation proche infrarouge, mélanger la solution polymère avec des nano tiges hydrophobes d’or à un rapport d’un à neuf et ajouter l’initiateur photo à un rapport de 0,005 à 1.
Injecter le mélange résultant dans un flacon de verre de 0,92 millilitre contenant 800 microlitres de 10% CMC et guérir les polybobbles sous la lumière ultraviolette comme démontré. Après le gel flash et la lyophilisation comme démontré, laver les polybubbles avec de l’eau déionisée et incuber les porteurs dans 400 microlitres de PBS à 37 degrés Celsius pour la période d’incubation appropriée. À la fin de l’incubation, obtenir une image infrarouge prospective du polybubble avant et après l’activation des polybubbles avec un laser proche infrarouge de 801 nanomètres à huit amplis pendant cinq minutes trois fois par semaine pendant quatre semaines pour les polybobbles PLGADA et 14 semaines pour les polybobbles PCL-PCLTA.
À chaque moment expérimental, recueillir le supernatant et ajouter 400 microlitres de PBS frais au flacon. Calculez ensuite les différences de température entre les polybubbles avant et après l’activation laser en fonction des valeurs de température des images infrarouges prospectives. L’ajout d’une solution aqueuse à base de 10 % de CMC entraîne une suspension complète en polybubble pour un entretien réussi de la sphérique polybubble.
L’injection de cargaison dans le polybubble en l’absence de CMC entraîne une fuite et un manque conséquent de rétention de la cargaison dans le polybubble. Pour remédier à cette fuite, la viscosité de la PCLTA peut être augmentée à l’aide de carbonate de potassium isolé après le plafonnement final du polycaprolactone avec du triacrylate et la viscosité de la cargaison peut être augmentée en mélangeant la cargaison avec 5% CMC. La viscosité des polybobbles PLGADA est suffisante pour faciliter le centrage de la cargaison et ne nécessite pas de modulation par carbonate de potassium.
Notez qu’aucune différence statistiquement significative dans l’efficacité contraignante de l’anticorps n’est observée après avoir mélangé l’antigène VIH gp120/41 avec et sans tréhalose avant l’injection de polybubble. Des rejets d’éclatement retardés sont observés dans les polybobbles PLGADA avec acriflavine au milieu le jour 19 pour les polybubbles incubés à 37 degrés Celsius et le cinquième jour pour les polybubbles incubés à 50 degrés Celsius. En outre, les polybobbles PLGADA et les polybobbles PCL et PCLTA contenant des nano tiges d’or peuvent être activés avec succès au laser plusieurs fois.
Lors de la formation des polybubbles, s’il vous plaît prendre soin de protéger les reagents de la lumière et aussi d’utiliser les solutions immédiatement. Après avoir développé cette technologie, nous avons également voulu explorer l’automatisation de ce processus à l’échelle de la production de polybubble.
