Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur la façon de filtrer les suppresseurs de silencing ARN sécrètent par des agents pathogènes végétaux. Le principal avantage de cette technique est de fournir un test de dépistage rapide, précis et étendu pour l’identification des suppresseurs de silencing ARN. Préparer des mélanges de terre en pot composés de 50 % de mousse de tourbe, de 30 % de perlite et de 20 % de vermiculite et d’autoclave à 120 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Faire tremper les mélanges de sol autoclavés avec la solution d’engrais végétal à un gramme par litre et les sous-emballage dans de plus petits pots stockés dans un plus grand plateau. Semer une ou deux graines de Nicotiana bethamiana 16c sur la surface du sol de chaque pot. Couvrir le plateau d’un dôme en plastique et laisser germer les graines.
Placez le plateau sous des chambres de croissance légères et à température contrôlée avec une température de 23 à 25 degrés Celsius, une humidité relative de 50 à 60 % et une longue journée de photopériod. Après trois à quatre jours, les graines germent. Enlever le dôme en plastique et permettre aux semis de croître dans les mêmes conditions utilisées pour l’étape de germination.
Tous les deux à trois jours, ajouter une quantité appropriée d’eau pour garder le sol humide, mais pas tremper. Tous les 10 jours, ajouter de l’engrais pour favoriser la croissance. Maintenir les plantes Nicotiana bethamiana 16c dans des conditions normales jusqu’à ce que les plantes aient au moins cinq vraies feuilles entièrement développées sans bourgeons axillaires ou floraux visibles et que les feuilles aient un aspect vert sain.
Utilisez des plantes Nicotiana bethamiana 16c de 10 à 14 jours pour des analyses systémiques de silencing d’ARN et des feuilles de trois à quatre semaines de Nicotiana bethamiana 16c pour des analyses locales de silencing d’ARN. Utilisez une pointe pour choisir une colonie positive de la plaque LB et inoculer les cellules dans un tube de verre contenant cinq millilitres de LB moyen complété par 50 microgrammes par millilitre kanamycine et 50 microgrammes par millilitre Rifampicin. Faire croître les cellules à 30 degrés Celsius en secouant à 200 RPM pendant 24 à 48 heures.
Transférer 100 microlitres de la culture en cinq millilitres de LB moyen complété par les mêmes antibiotiques, 10 millimilliles MES au pH 5,6, et 20 micromolaire AS. Faire croître la bactérie à 30 degrés Celsius en secouant à 200 RPM pendant 16 à 20 heures. Centrifuger les cellules à 4000 fois g pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille en deux millilitres de tampon de chlorure de magnésium de 10 millimaux.
Répétez le lavage pour assurer l’élimination complète des antibiotiques. Déterminer la densité de la culture Agrobacterium en mesurant la densité optique à 600 nanomètres. Ajustez la culture cellulaire avec un tampon de chlorure de magnésium de 10 millimlaires à un OD 600 de 1,5 à 2,0.
Ajouter 10 millimilliles MES au pH 5.6 et 150 micromolaires AS à la culture finale de suspension et incuber les cellules à température ambiante pendant au moins trois heures sans trembler. Mélanger des volumes égaux d’une culture Agrobacterium contenant 35S protéines fluorescentes vertes avec une culture Agrobacterium contenant 35S concombre mosaïque suppresseur de virus 2b, effecteur putatif ou vecteur vide. À l’aide d’une seringue sans aiguille d’un millilitre, infiltrez soigneusement et lentement les suspensions agrobactériennes mélangées sur les côtés abaxiaux des feuilles de Nicotiana bethamiana 16c.
Retirez le reste de la suspension bactérienne des feuilles avec des lingettes de tissus mous et encerclez les marges des plaques infiltrées à l’aide d’un stylo marqueur. Trois à quatre jours après l’infiltration, utilisez une lampe ultraviolette à ondes longues pour détecter visuellement la fluorescence GFP dans les plaques infiltrées des feuilles. Deux semaines après l’infiltration, utilisez la lampe pour détecter les feuilles nouvellement cultivées de toute la plante pour le silencing systémique d’ARN.
Pour isoler l’ARN total du tissu foliaire à quatre à sept jours après l’infiltration, recueillir les tissus foliaire des plaques nicotiana bethamiana 16c infiltrées dans un mortier. Placer l’azote liquide dans le mortier et moudre le tissu en poudre fine à l’aide d’une tige de broyage et transférer la poudre dans un tube stérile de deux millilitres. Ajouter immédiatement le réageni d’isolement de l’ARN au volume d’un millilitre par 100 milligrammes de tissu au tube de l’échantillon dans une hotte, vortex vigoureusement pour homogénéiser, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.
Ajouter du chloroforme au volume de 200 microlitres par millilitre de réaccente d’isolement arn à chaque tube du capot, agiter vigoureusement pendant 15 secondes et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifugeuse l’homogénéisation à 12 000 fois g pendant 15 minutes à 4 degrés Celsius. Transférer le supernatant dans un nouveau tube sans RNase et jeter la pastille.
Ajouter 0,7 volume d’isopropanol au supernatant, inverser délicatement plusieurs fois et incuber le mélange à température ambiante pendant 10 minutes. Précipitez la pastille d’ARN par centrifugation à 12 000 fois g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnatant.
Laver la pastille avec 70% d’éthanol et sécher à l’air le granulé dans une hotte. Dissoudre l’ARN dans de l’eau traitée au pyrocarbonate de désyle en couveant dans un bain d’eau de 65 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes. Pour effectuer l’analyse de tache nordique des niveaux d’ARN messager de GFP, préparez un gel d’agarose de denarose de denaturing de formaldéhyde de 1X MOPS exécutant le tampon.
Mélanger l’ARN en un à un avec le colorant de chargement de l’ARN et dénoaturer l’ARN par incubation à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Réfrigérer immédiatement les échantillons dénaturés sur la glace pendant une minute. À l’aide d’une pipette, charger les échantillons dans les puits du gel et de l’électrophorese à 100 volts pendant 50 minutes jusqu’à ce que l’ARN soit bien séparé.
Rincer le gel en tampon de citrate de sodium salin 20X pour enlever le formaldéhyde. Effectuez le transfert capillaire pendant la nuit en installant 20X tampon de citrate de sodium salin, une couche de papier essuie-tout, deux couches de papier Whatman humide, une couche de gel, une couche de membrane de nylon, deux couches de papier Whatman humide, deux couches de papier Whatman sec, une plaque de verre et un poids. Le matin, l’ARN dans le gel est transféré à la membrane de nylon.
Tremper la membrane dans le citrate de sodium salin 2X et fixer l’ARN à la membrane en exposant la membrane humide à la liaison croisée UV. Procéder selon le manuscrit. Les feuilles entièrement développées des plantes nicotiana bethamiana 16c de trois à quatre semaines ont été co-infiltrées dans des parcelles avec des mélanges Agrobacterium transportant 35S GFP.
À quatre jours après l’infiltration, la fluorescence GFP de la zone infiltrée a été photographiée sous la lumière naturelle et la lumière UV à ondes longues. La tache nordique a indiqué que l’ARN messager de GFP s’est accumulé plus haut dans les feuilles exprimant 35S GFP plus 35S CMV2b ou 35S GFP plus 35S PSR1 que dans les feuilles exprimant 35S GFP plus EV. L’analyse d’agroinfiltration a été effectuée pour évaluer la propagation du signal de silence dans les feuilles des semis nicotiana bethamiana 16c de deux semaines. À 14 jours après infiltration, plus de 98% de l’EV n’a montré aucune signalisation évidente de GFP dans les feuilles systémiques.
Considérant que cmv2b et PSR1 ont efficacement inhibé la propagation systémique du signal de silence. La fluorescence du GFP a été observée dans environ 80 % des plantes co-infiltrées et dans les 20 % restants des plantes infiltrées avec seulement quelques veines rouges apparues dans les feuilles nouvellement émergées. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour identifier de nouveaux suppresseurs de silencing d’ARN sécrés par beaucoup d’agents pathogènes végétaux.
La combinaison des plantes et de l’OD approprié est la chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure. Après cette procédure, la caractérisation fonctionnelle du suppresseur de silence ARN peut être faite pour explorer le mécanisme de la façon dont ces suppresseurs appuient sur le silence de l’ARN hôte et quelle est la sortie. S’il vous plaît porter les lunettes de sécurité lorsque vous infiltrez les plantes et aussi porter les gants de latex pendant toutes les étapes de l’expérience.
