Ce protocole peut être utilisé pour produire des films en accéléré de Pseudomonas aeruginosa grouillant et pour capturer la répulsion de l’essaim par bactériophage ou antibiotiques. Les films en accéléré capturent la dynamique détaillée de la réponse grouillante aux antibiotiques et au bactériophage et la technique ne nécessite qu’un déshumidificateur, un ordinateur, un incubateur et un scanner de documents. Pour préparer des plaques d’agar grouillantes pour l’imagerie grouillante de P.aeruginosa, utilisez une pipette de 25 millilitres pour ajouter 20 millilitres de solution d’agar grouillante à chaque boîte de Pétri expérimentale de 10 centimètres de diamètre.
Placer les assiettes dans une seule pile avec couvercles pendant une heure à température ambiante. Allumez un déshumidificateur pour réduire l’humidité relative de la pièce à 40-50 %Lorsque l’agar s’est solidifiée, séchez les plaques d’agar grouillantes pendant 30 minutes supplémentaires dans un capot d’écoulement laminaire avec les couvercles éteints et faites face à 300 pieds cubes par minute avec une humidité relative de 40 à 50 % à température ambiante. Rangez ensuite les plaques d’agar grouillantes séchées à quatre degrés Celsius jusqu’à 24 heures.
Pour le placage d’agar grouillant, maintenez une pointe de pipette P20 chargée de cinq microlitres d’une culture p.aeruginosa de nuit à un angle de 10-45 degrés 2-1/2 centimètres au-dessus du centre d’une plaque grouillante et déprimez le piston au premier arrêt touchant l’agar avec seulement la chute liquide. Utilisez un modèle pour positionner l’endroit uniformément à travers les différentes plaques d’agar grouillantes. Pour plaquer une infection de phage, mélangez d’abord 30 microlitres de P.aeruginosa cultivé pendant la nuit avec six microlitres d’une fois 10 aux 12 unités de formation de plaque par millilitre de phage DMS3 vir et ajoutez immédiatement six microlitres du mélange de phage de P.aeruginosa à six positions satellites équidistantes sur un cercle concentrique de rayon de 2,8 centimètres tel que démontré.
Utilisez un modèle pour positionner l’endroit uniformément à travers différentes plaques d’agar grouillantes. Pour plaquer les traitements antibiotiques, mélanger 30 microlitres de P.aeruginosa cultivé pendant la nuit avec la concentration et le volume appropriés de l’antibiotique d’intérêt et ajouter immédiatement six microlitres des bactéries traitées aux antibiotiques à six positions satellites équidistantes sur un cercle concentrique de rayon de 2,8 centimètres autour du centre du plat. Utilisez un modèle pour positionner l’endroit uniformément à travers les différentes plaques d’agar grouillantes.
Lorsque toutes les cultures ont été plaquées, remplacez les couvercles de boîte petri transparents par des couvercles noirs sur mesure. Placez soigneusement les plaques d’agar grouillantes sur un scanner dans un incubateur réglé à 37 degrés Celsius avec un bain d’eau de 10 litres pour maintenir l’humidité à 75%Après avoir placé les plaques dans le scanner, ouvrez le fichier et enregistrez les paramètres pour définir le chemin d’enregistrement pour les images et cliquez sur balayage et OK à intervalles de 30 minutes. Pour automatiser l’acquisition de l’image, utilisez le logiciel de script.
Sélectionnez à la fois la numérisation au ralenti et l’analyse unique et cliquez à droite sur la numérisation au ralenti, puis cliquez à gauche sur activé. À la fin de l’incubation, importez toutes les images numérisées dans ImageJ. Dans la fenêtre d’options de séquence, le nombre d’images indiquera le nombre d’images sélectionnées.
Continuez l’image à un pour commencer à partir de la première image dans le dossier et les images d’échelle à 100% pour conserver la taille originale des images. Cliquez secrètement sur RGB pour garder les images en couleur. Laissez l’utilisation de la pile virtuelle non contrôlée et cliquez sur OK pour charger les images.
Cliquez sur fichier, enregistrer comme et AVI pour fusionner les images dans un fichier AVI. Réglez la compression en JPEG et la vitesse d’image à cinq images par seconde. Enregistrez ensuite le time-lapse AVI dans le dossier de stockage approprié.
L’imagerie en accéléré d’une seule colonie de P.aeruginosa de type sauvage à partir d’une plaque d’agar LB dans le bouillon LB pendant la nuit à 37 degrés Celsius et repérée au centre d’une plaque d’agar grouillante révèle une croissance initiale sous la forme d’une colonie au centre de la plaque qui se propage dans les vrilles radialement de la colonie. Les essaims se déplacent du centre des plaques d’agar grouillantes vers la périphérie et sont repoussés par un signal de stress émis par les bactéries infectées par des phages ou traitées par la gentamycine. Les phages ou la gentamycine repérés seuls aux positions satellites ne font pas enroumer les populations pour éviter ces zones.
Utilisez une pipette de 25 millilitres pour vous assurer que les plaques d’agar grouillantes contiennent exactement 20 millilitres. Il est également important d’ajuster le temps de séchage des plaques en fonction de l’environnement du laboratoire. Notre technique nous permet de visualiser les modèles grouillants globaux des populations de Pseudomonas aeruginosa.
L’objectif suivant est de surveiller la motilité cellulaire individuelle à l’aide de la microscopie Brightfield.
