Le but global de cette méthode est d’analyser l’effet du traitement du stress sur les cellules bactériennes, à la fois à la cellule unique et au niveau de la population. Il fournit une vision globale de l’effet du stress sur plusieurs aspects de la croissance bactérienne, y compris la viabilité cellulaire, la morphologie et la teneur en ADN. Il permet également de caractériser le rétablissement de la population.
Cette méthode pourrait être utilisée dans l’industrie pharmaceutique pour dépister l’activité de la nouvelle molécule antimicrobienne et apprécier leur impact sur la viabilité et la croissance des bactéries. Le traitement induisant le stress a une inefficacité, comme la dose et dépendant du temps. Il peut être nécessaire d’exécuter des tests préliminaires pour déterminer la dose optimale et la durée du traitement avant de commencer ce protocole.
La démonstration visuelle de cette méthode permet d’imaginer des détails importants de chaque étape critique et comment les exécuter correctement. Pour commencer, inoculer cinq millilitres de MOPS EZ Rich Defined Medium avec une seule colonie d’E.Coli MG1655 HU-PAmCherry et croître à 37 degrés Celsius avec des secousses à 140 rotations par minute pendant la nuit. Le lendemain matin, extraire 100 microlitres de l’échantillon et le diluer avec 900 microlitres de milieu pour mesurer la densité optique à 600 nanomètres.
Ensuite, diluer la culture dans un tube à essai contenant du milieu frais à un OD600 nanomètres de 0,01. Incuber le tube à essai inoculé à 37 degrés Celsius avec secousse à 140 RPM jusqu’à ce que la densité optique atteint 0,2, correspondant à la phase exponentielle complète dans le milieu riche. Ensuite, aliquot les échantillons de culture pour l’imagerie par microscopie time-lapse, la dilution et l’analyse de placage, l’analyse de cytométrie de flux, et l’imagerie instantanée de microscopie.
Exposez les 4,4 millilitres restants de la culture cellulaire dans le tube à essai à un traitement spécifique du stress. Par exemple, 4,4 microlitres de céphalexine à cinq microgrammes par millilitre et incuber à 37 degrés Celsius avec secousse à 140 RPM. Préparez dix dilutions en série, jusqu’à 10 à moins sept, des 200 microlitres d’échantillon de culture dans un milieu frais.
Mélanger entre chaque dilution par vortex très doux ou en inversant le tube. Plaque 100 microlitres de la dilution appropriée sur les plaques d’agarose LB non sélectionnées et incuber pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, comptez le nombre de colonies pour déterminer la concentration de cellules viables dans chaque échantillon de culture.
Tracez le CFU par millilitre en fonction du temps pour les cultures cellulaires non traitées et traitées. Mesurer l’OD600 de la culture sur un spectrophotomètre. Diluer l’échantillon de culture avec un milieu frais à quatre degrés Celsius pour obtenir un échantillon avec OD600 à 0,06, correspondant à environ 15 000 cellules par microlitre.
Pour la coloration de l’ADN, mélanger l’échantillon bactérien dilué avec une solution millilitre de 10 microgrammes par millilitre de colorant fluorescent à l’ADN à la ration de volume de un à un et incuber dans l’obscurité pendant 15 minutes. Avant l’injection de l’échantillon, mélanger l’échantillon par vortex très doux ou en inversant le tube. Passez l’échantillon dans le cytomètre d’écoulement à un débit d’environ 120 000 cellules par minute.
Acquérir de la lumière éparse vers l’avant et éparpillée latéralement ainsi que du colorant fluorescent d’ADN/signal fluorescent avec les réglages appropriés. Tracez l’histogramme de densité cellulaire épars vers l’avant pour représenter la distribution de la taille des cellules et tracer l’histogramme de densité fluorescente de colorant fluorescent/cellule de signal fluorescent de l’ADN pour représenter la teneur en ADN dans la population cellulaire. Tout d’abord, préchauffer la chambre de microscope thermostatée à 37 degrés Celsius pour stabiliser la température.
Préparez les diapositives montées sur l’agarose telles que décrites dans le manuscrit. Placez la diapositive sur l’étape du microscope et effectuez l’acquisition d’images à l’aide de la lumière transmise avec un objectif de contraste du visage et avec une excitation de source lumineuse à 560 nanomètres pour mCherry. Sélectionnez les champs de vision qui contiennent des cellules isolées afin de faciliter la détection automatisée des cellules lors de l’analyse d’images.
Assurez-vous qu’au moins 300 cellules sont photographiées pour permettre une analyse statistique robuste de la population cellulaire. Tout d’abord, retirez la solution de conservation de la plaque microfluidique et remplacez-la par un milieu frais préchauffé à 37 degrés Celsius tel que décrit dans le Guide des utilisateurs de logiciels microfluidiques. Attachez la plaque microfluidique au système multiple.
Et dans le logiciel microfluidique, cliquez sur le bouton Seal pour sceller sur la plaque le système multiple. Après cela, cliquez sur le bouton d’amorçage. Placez la plaque microfluidique avec le système multiple au stade du microscope et préchauffez à 37 degrés Celsius pendant deux heures pour éviter la dilatation de la chambre microfluidique.
Scellez la plaque microfluidique sur le système microfluidique en cliquant sur le bouton Seal Off. Remplacer le milieu du puits huit par 150 microlitres d’échantillon de culture et remplacer le milieu du puits un à cinq par le milieu désiré, avec ou sans le réacompteur induisant le stress. Sceller la plaque microfluidique et la placer au microscope.
Dans le logiciel microfluidique, exécutez la procédure de chargement cellulaire. Vérifiez que le chargement des cellules est satisfaisant en regardant sous le microscope dans la lumière transmise. Concentrez-vous soigneusement en mode lumière transmise et sélectionnez plusieurs champs de vision qui présentent des bactéries isolées et ne sont pas surpeuplés, soit environ 10 à 20 cellules par 100 microlitres carrés.
Dans le logiciel microfluidique, cliquez sur le bouton Exécuter une séquence personnalisée, puis programmez l’injection du support induisant le stress pendant 10 minutes à deux ISP, suivie d’une injection à un PSI pour la durée souhaitée du traitement de stress. Effectuez l’imagerie par microscopie en mode time-lapse avec un cadre toutes les 10 minutes, en utilisant le contraste de phase dans la lumière transmise et une source de lumière d’excitation de 560 nanomètres pour le signal mCherry si nécessaire. Commencez l’acquisition d’images microscopiques et le protocole d’injection microfluidique en même temps.
Ouvrez le logiciel Fidji et le plugin MicrobeJ. Pour l’analyse instantanée, déposez toutes les images correspondant à une diapositive microscope dans la barre de chargement MicrobeJ pour concatenate images et enregistrer le fichier piles d’images obtenues. Pour les données time-lapse, il suffit de laisser tomber la pile d’images dans la barre de chargement de MicrobeJ.
Exécutez la détection automatisée des contours de la cellule en fonction de la segmentation de l’image de contraste de phase et exécutez la détection des nucléoïdes en fonction de la segmentation du signal fluorescent d’ADN souillé. Vérifiez l’exactitude de la détection cellulaire visuellement et utilisez l’outil d’édition MicrobeJ pour la correction si nécessaire. Enregistrez le fichier de résultat obtenu.
Cliquez sur l’icône ResultJ pour compléter l’analyse et obtenir la fenêtre ResultJ. De nombreux types de graphiques de sortie sont générés. Tracez les histogrammes normalisés de la forme ou de la longueur des cellules et du nombre nucléoïde moyen par cellule.
Cette étude a analysé le comportement des cellules K-12 d’Escherichia coli pendant l’exposition transitoire à la céphalexine, un antibiotique qui inhibe spécifiquement la division cellulaire. Les cultures cellulaires qui se développent en présence de céphalexine ont montré des augmentations similaires de l’OD600 à mesure que les cultures non stressées. La concentration des cellules viables n’a pas augmenté quand la céphalexine était présente.
Les cellules ont commencé à se diviser à nouveau lorsque la céphalexine a été enlevée et a finalement atteint une concentration équivalente à la culture non stressée après deux heures. Différentes contraintes ont entraîné un découplage différent des courbes od et CFU par millilitre, selon l’effet induit. L’exposition à la céphalexine a provoqué une augmentation parallèle de la taille des cellules et de la teneur en ADN.
Quand la céphalexine a été enlevée, la taille et la teneur en ADN de cellules de population ont graduellement diminué et sont devenues semblables à la population non stressée après deux heures. La céphalexine a provoqué la formation de longues cellules avec la largeur normale de cellules alors aucun septa de division. L’analyse quantitative de l’image a confirmé l’augmentation de la taille des cellules et de la teneur en ADN.
Les images en accéléré confirment que l’allongement cellulaire et la réplication et la ségrégation chromosomiques n’ont pas été inhibés par l’exposition à la céphalexine. L’analyse de la lignée cellulaire filamentée a montré que la division cellulaire a redémarré environ 20 minutes après avoir emporté le médicament. Il est crucial de s’assurer que la population bactérienne est en pleine croissance exponentielle avant d’induire des traitements contre le stress.
Le traitement induisant le stress utilisé pour ces approches pourrait être dangereux pour l’expérimental, comme le composé génotoxique. Alors manipulez le composé soigneusement et portez le gant, le masque, les lunettes, et le manteau de laboratoire.
