Les protocoles Hi-C du noyau permettent l’exploration de la confirmation chromosomique à différentes résolutions pour la caractérisation des boucles de chromatine, des domaines et des compartiments organisant le génome. Ce protocole fournit un profilage à haute résolution des interactions génomiques à différentes échelles, ce qui permet une couverture plus cohérente sur toute la gamme des distances et des données génomiques avec moins de bruit technique. La combinaison de ce protocole avec l’édition génétique est une stratégie puissante pour tester la fonction structurelle des éléments génétiques.
Il peut également être appliqué à la caractérisation des variations structurelles qui conduisent à la maladie. Le protocole Hi-C du noyau peut être appliqué pour explorer l’organisation du génome de tout génome eucaryote. Le traitement SDS et Triton désagrège tout amas nucléaire par pipetage, car les agrégats interfèrent avec l’efficacité de la réaction enzymatique et assurez-vous d’effectuer les contrôles de qualité appropriés avant le séquençage.
Commencez par ajouter du formaldéhyde sans méthanol à une fois 10 des sept cellules de la drosophile de la ligne 2 Plus de Schneider dans 17,5 millilitres de milieu Schneider complétés par 10% FBS à une concentration finale de 2% Incuber les cellules pendant 10 minutes à température ambiante en mélangeant toutes les 60 secondes ou sur une roue tournante, et ajoutez de la glycine à une concentration finale de 0,125 molaire avec mélange. Après cinq minutes à température ambiante et 15 minutes sur glace, prélever les cellules par centrifugation et ressuspender soigneusement la pastille dans 25 millilitres de PBS froid et prélever les cellules avec une autre centrifugation. À la fin de la centrifugation, ressuspendez les cellules dans un millilitre de tampon de lyse glacée pour le comptage et ajustez les cellules à une fois 10 à la concentration de six cellules par millilitre.
Incuber les cellules sur de la glace pendant 30 minutes, en inversant le tube toutes les deux minutes pour mélanger et recueillir les cellules avec une autre centrifugation. Resuspendez la pastille dans un millilitre de tampon de lyse glacée fraîche. Après centrifugation, laver le lysate avec un millilitre de tampon de restriction 1,25X.
Centrifuger à nouveau pour recueillir le lysate. Resuspendez la pastille dans 360 microlitres de tampon de restriction frais et 11 microlitres de FDS à 10% avec un pipetage soigneux et incubez pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius et 7 à 950 tours par minute avec pipetage occasionnel. À la fin de l’incubation, arrêtez la perméabilisation avec 75 microlitres de tensioactif non ionique et retournez le tube dans l’incubateur pendant 45 minutes supplémentaires en agitant à 950 tours par minute avec pipetage occasionnel.
Pour la digestion de la chromatine, ajoutez 200 unités de Mbo1 au tube pour une incubation de quatre à 16 heures à 37 degrés Celsius avec rotation. À la fin de l’incubation, inactivez l’enzyme avec une incubation de 20 minutes à 60 degrés Celsius. Pour remplir les surplombs de fragments de restriction et étiqueter les extrémités de l’ADN avec de la biotine, ajoutez 1,5 microlitre chacun de 10 millimolaires dCTP, dGTP, dTTP, 20 microlitres de 0,4 millimolaire biotine dATP, 17,5 microlitres de tampon tris low EDTA et 10 microlitres de cinq unités par microlitre d’ADN polymérase un gros fragment au tube avec un mélange soigneux.
Incuber la réaction pendant 75 minutes à 37 degrés Celsius en secouant à 700 tours par minute toutes les 10 secondes pendant 30 secondes. À la fin de l’incubation, ajoutez le mélange de ligature à la chromatine et ajustez-le à un millilitre de volume de réaction final avec un mélange doux et approfondi et incubez pendant la nuit à 16 degrés Celsius. Pour dégrader les protéines de l’échantillon, ajoutez 50 microlitres de 10 milligrammes par millilitre de protéinase K au tube pour une incubation de deux heures à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, augmentez la température à 65 degrés Celsius pendant la nuit pour inverser la réticulation de l’échantillon. Le lendemain matin, dégradez l’ARN avec 10 microlitres de 10 milligrammes par millilitre ARNi A.Après une heure à 37 degrés Celsius, ajoutez un volume de chloroforme phénolique au tube et mélangez soigneusement par inversion pour obtenir une phase blanche homogène. Après avoir précipité l’ADN selon des protocoles standard, quantifiez l’ADN à l’aide d’un colorant fluorogénique qui se lie sélectivement à l’ADN et d’un fluoromètre selon les instructions du fabricant.
Pour purifier l’ADN des aliquotes non digérées et digérées, chargez 100 nanogrammes d’échantillons non digérés, digérés et ligaturés sur un gel d’agarose à 1,5% et recherchez un frottis centré autour de 500 paires de bases dans l’échantillon digéré par rapport à une bande de poids moléculaire élevé pour l’échantillon ligaturé. Pour vérifier le marquage Hi-C et l’efficacité de la ligature par amplification et digestion d’une interaction connue, après PCR, digérer les produits avec Mbo1, Cla1 ou les deux, et exécuter les échantillons sur un nouveau gel de 1,5 à 2% pour permettre l’estimation du nombre relatif de jonctions de ligature 3C et Hi-C. Après avoir soniquer l’échantillon pour obtenir 200 à 500 fragments d’ADN de paire de bases, transférer 130 microlitres avec cinq microgrammes d’ADN de chaque échantillon dans de nouveaux tubes de microcentrifugation contenant 16 microlitres de tampon de ligature 10X, deux microlitres de dATP de 10 millimolaires, cinq microlitres d’ADN polymérase T4 et sept microlitres d’eau double distillée pour une incubation de 30 minutes à 20 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, ajouter cinq microlitres de dNTP de 10 millimolaires, quatre microlitres de tampon de ligature 10X, cinq microlitres de polynucléotide kinase T4, un microlitre d’ADN polymérase, un gros fragment et 25 microlitres d’eau double distillée aux tubes pour une deuxième incubation de 30 minutes à 20 degrés Celsius. Pour sélectionner des fragments principalement dans la gamme de taille de paire de bases 250 à 550, effectuez une sélection séquentielle de la taille de la phase solide réversible et de la mobilisation avec 0,6X, puis 0,9X selon les instructions du fabricant et éluez l’ADN avec 100 microlitres de tris low EDTA. Pour le retrait de la biotine pour chaque bibliothèque, lavez deux fois 150 microlitres de billes magnétiques liées à la streptavidine avec 400 microlitres de tampon 1X Tween et faites pivoter les échantillons pendant trois minutes sur une roue rotative.
À la fin de l’incubation, remettez en caisse les billes dans 300 microlitres de 2X sans tampon Tween et mélangez-les avec 300 microlitres de matériau Hi-C pour une rotation de 30 minutes sur une roue rotative. À la fin de l’incubation, lavez les billes avec 400 microlitres de tampon d’interpolation 0,5X pour une incubation de trois minutes à 55 degrés Celsius et 750 tours par minute, suivie de deux lavages en 200 microlitres de 1X tampon de restriction par lavage. Après le deuxième lavage, ressuspendez les billes dans 100 microlitres de mélange de résidus dATP pour une incubation de 30 minutes à 37 degrés Celsius.
À la fin de l’incubation, remettez en suspension les billes dans 50 microlitres de tampon de ligature 1X et transférez la suspension dans un nouveau tube contenant quatre microlitres d’adaptateurs d’extrémité appariés pré-recuits et deux microlitres de ligase T4. Après deux heures à température ambiante, retirez le surnageant et lavez les perles deux fois avec 400 microlitres de tampon Tween, puis lavez les perles une fois avec 200 microlitres sans tampon Tween et une fois avec 100 microlitres de tampon de restriction avant de suspendre à nouveau les perles dans 40 microlitres de tampon de restriction 1X. Un frottis de 200 à 1 000 paires de bases est observé lorsque la restriction avec Mbo1 est réussie.
Si la ligature réussit, une bande de poids moléculaire élevé est observée au sommet du gel. L’efficacité de la digestion peut également être confirmée par PCR quantitative. Une efficacité de digestion acceptable est de 80% ou plus.
Comme illustré, l’amplification d’une interaction connue à moyenne portée dans les produits de ligature Hi-C peut être estimée par digestion du produit PCR récupéré dans l’amplification. Une efficacité de digestion de plus de 70% est recommandée pour éviter d’avoir une grande proportion de lectures inutiles pour les bibliothèques après le séquençage. Le nombre de cycles de PCR pour l’amplification finale doit être inférieur d’un cycle au nombre de cycles pour lesquels le frottis est visible.
Le niveau de digestion de la bibliothèque indique l’abondance des paires Hi-C valides et reflète la proportion de lectures utiles qui seront obtenues à partir de la bibliothèque. En utilisant les paires Hi-C valides uniques, une analyse de base de la distribution des paires peut être effectuée. Comme observé dans cet exemple représentatif, le locus du gène NOTCH peut être vu avec les protéines architecturales, les domaines un et deux, et les modifications des histones le long du locus.
Lors de la suppression de la région contenant à la fois les sites de liaison à l’ADN CTCF et M1BP, un changement spectaculaire dans les contacts de chromatine peut être observé. Après l’expérience Hi-C, un peut être effectué pour atteindre un ensemble spécifique de contacts, par exemple, à partir de régions promotrices. Ceci est particulièrement utile lors de l’évaluation de grands génomes.
Comme démontré, la combinaison du protocole Hi-C avec l’addition génétique peut être utilisée pour évaluer la fonction structurelle et régulatrice des éléments génomiques.
