Ce travail a été soutenu par la subvention DK32083 des NIH, les subventions 2-SRA-2015-51-Q-R et 2-SRA-2018-533-S-B de FRDJ.

Le protocole de recherche a été approuvé par le Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Préparation du tampon
<ol><li>Fabriquez le tampon d’étiquetage (2x PBS, pH 7,9). À l’aide de 400 mL d’eau distillée désionisée (DD), ajouter 100 mL de 10x PBS. Pour ajuster le pH de la solution, ajouter NaOH jusqu’à ce qu’il atteigne 7,9.</li>
	<li>Créer 3 mM de biotine en dissolvant 1 mg de biotine dans 588 μL de tampon d’étiquetage préalablement créé. Faire 3 mM Ru Sulfo-NHS en dissolvant 150 nmol de Ru Sulfo-NHS dans 50 μL de tampon de marquage.</li>
	<li>Fabriquer le tampon antigénique (1 % de BSA) en prenant 500 mL de 1x PBS et en ajoutant 5 g d’albumine sérique bovine (BSA) à la solution. Préparer 0,5 M de solution d’acide acétique. Préparez le tampon Tris-HCl 1 M en utilisant Trizma Base et en ajustant le pH à 9,0.</li>
	<li>Pour le tampon de revêtement (3% Blocker A), prendre 500 mL de 1x PBS et ajouter 15 g de Blocker A. Préparer le tampon de lavage (0,05% Tween 20, PBST) en mélangeant 5000 mL de 1x PBS avec 2,5 mL de Tween 20. Créez un tampon de lecture (2x tampon de lecture T avec surfactant) en ajoutant 500 ml d’eau DD et 500 ml de tampon de lecture T 4x avec surfactant. REMARQUE: Pour maintenir la cohérence entre les essais, il est important que les solutions de biotine et de Ru Sulfo-NHS soient créées juste avant la procédure d’étiquetage et ne soient pas créées et stockées pour une utilisation future.</li>
</ol>2. Marquage de chaque protéine antigénique avec de la biotine et du Ru Sulfo-NHS séparément
REMARQUE: Pour avoir une réaction de marquage plus efficace, utilisez une concentration de protéines antigéniques de ≥0,5 mg / mL.
<ol><li>Calculer le nombre molaire de chaque protéine antigénique et le nombre molaire de la biotine et du Ru Sulfo-NHS. Ajouter une quantité appropriée de biotine ou de Ru Sulfo-NHS à la protéine antigénique pour marquer la réaction en fonction du rapport molaire de la protéine antigénique à la biotine ou Ru Sulfo-NHS.<ol><li>Pour l’antigène qui a le plus petit poids moléculaire (≤10 kDa), comme la protéine proinsuline, utilisez un rapport molaire de 1:5 (antigène: biotine et Ru Sulfo-NHS). Pour l’antigène qui a le plus grand poids moléculaire (>50 kDa), comme la protéine GAD, utilisez un rapport molaire de 1:20. Pour l’antigène qui a un poids moléculaire moyen (10-50 kDa), utilisez un rapport molaire ajusté entre 1:5-1:20.</li>
	</ol></li>
	<li>Pour la biotine et le Ru Sulfo-NHS, divisez chaque poids d’antigène par leur poids moléculaire correspondant pour obtenir le nombre molaire d’antigène pour chacun. Divisez le nombre molaire par la concentration pour obtenir le volume de biotine. Répétez cette opération pour Ru Sulfo-NHS.</li>
	<li>Mélanger la protéine antigénique avec de la biotine en utilisant le rapport molaire approprié, déterminé à l’étape 2.2. Ensuite, faites de même pour Ru Sulfo-NHS. REMARQUE: Pour une réaction de marquage efficace, tous les produits chimiques réducteurs tels que le Tris ou la glycine dans le système tampon doivent être remplacés par un tampon PBS 2x, pH 7,9 par la colonne de spin de dimensionnement. Les protocoles d’étiquetage pour la biotine et le Ru Sulfo-NHS sont identiques.</li>
	<li>Couvrir les tubes de réaction avec du papier d’aluminium et les incuber à température ambiante (RT) pendant 1 h. La raison pour laquelle les tubes de réaction sont recouverts de papier d’aluminium est que les réactifs de biotine et de Ru Sulfo-NHS sont sensibles à la lumière.</li>
	<li>Amorcer la colonne de spin de 2 mL ou 5 mL pendant l’incubation des tubes de réaction (la taille de la colonne de spin est déterminée par le volume téléchargé sur la colonne). Remplissez la colonne de spin avec 2x tampon PBS, puis centrifugez-la à 1 000 x g pendant 2 minutes à chaque fois, pour un total de trois fois.</li>
	<li>Arrêtez la réaction d’étiquetage une fois que les tubes de réaction ont fini d’incuber. Pour arrêter la réaction, purifiez la protéine antigénique marquée en la faisant passer une fois dans la colonne de spin. Centrifuger ensuite la colonne à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
	<li>Calculer la concentration totale d’antigène marqué en divisant la quantité de protéine antigénique présente par le volume final. Aliquote 50 μL de la protéine antigénique marquée purifiée par tube et conserver les aliquotes à -80 °C pour une utilisation à long terme. REMARQUE: Il est important de savoir que pour chaque fois que la colonne de spin passe la protéine antigénique, il y aura un taux de rétention d’environ 90-95%.</li>
</ol>3. Définir la meilleure concentration et les meilleurs rapports pour les deux antigènes marqués pour le test (test en damier)
REMARQUE: Étant donné que le test ECL-IAA dans ce test 7-Plex nécessite un traitement acide des échantillons de sérum, le test en damier pour chaque antigène doit passer par cette étape avant d’incuber avec le mélange d’antigènes marqué.
<ol><li>Appliquez le test en damier pour chaque antigène séparément avant d’exécuter le test multiplex. Les étapes 3.2 à 3.6 utiliseront GAD65 comme exemple.</li>
	<li>Calculer la dilution de la protéine GAD65 marquée. La concentration ciblée recommandée de la première solution de mélange de GAD65 biotinylé est de 2000 ng / mL et Ru Sulfo-NHS marqué GAD65 est de 1000 ng / mL. Si la concentration de GAD65 biotinylé et de Ru Sulfo-NHS marqué GAD65 dans la solution mère est de 1,0 μg/μL, le volume nécessaire pour le GAD65 biotinylé dans 560 μL de solution de travail sera de 1,12 μL, et le volume nécessaire pour le Ru Sulfo-NHS marqué GAD65 dans 700 μL de solution de travail sera de 0,7 μL.</li>
	<li>Mélanger 1,12 μL de protéine GAD65 biotinylée avec 240 μL de linker conjugué streptavidine 1 dans un tube et 160 μL de BSA à 1%. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min. Ajouter 160 μL de solution stop dans le tube et incuber le mélange à température ambiante pendant encore 30 min.</li>
	<li>Faire une dilution en série. Prendre 280 μL du mélange dans un nouveau tube et ajouter 280 μL de solution stop pour obtenir une dilution 1:2. Préparez plusieurs nouveaux tubes. Répétez cette étape pour exécuter une dilution en série horizontale de l’antigène GAD65 marqué à la biotine (voir la publication précédente12).</li>
	<li>Mélanger 0,7 μL de protéine GAD65 marquée au Ru Sulfo-NHS (1 μg/μL) avec 700 μL de solution stop. Ensuite, prendre 350 μL du mélange dans un nouveau tube et ajouter 350 μL de solution stop pour obtenir une dilution 1:2. Préparez plusieurs nouveaux tubes, répétez cette étape pour exécuter une dilution en série verticale pour l’antigène GAD65 marqué par Ru Sulfo-NHS.</li>
	<li>Préparer deux échantillons de sérum, un échantillon très positif pour GADA et un échantillon négatif pour GADA, chacun ayant un volume de 0,75 mL. Aliquote 15 μL de sérum positif dans chaque puits de la moitié gauche de la plaque PCR à 96 puits. Aliquote 15 μL de sérum négatif dans chaque puits de la moitié droite de la plaque PCR à 96 puits.</li>
	<li>Ajouter 18 μL d’acide acétique 0,5 M dans chaque puits et mélanger. Incuber pendant 45 min à TA. Préparer une nouvelle plaque PCR à 96 puits. Ajouter 17,5 μL de l’antigène marqué à la biotine et 17,5 μL de l’antigène marqué Ru Sulfo-NHS dans chaque puits selon les dilutions en série (voir la publication précédente12).</li>
	<li>Continuez le reste des étapes de dosage décrites aux étapes 5.2 à 9.1.</li>
	<li>Déterminer le rapport de signal des échantillons fortement positifs par rapport aux signaux d’échantillons négatifs correspondants. Sélectionnez la meilleure concentration pour l’antigène marqué à la biotine et l’antigène marqué Ru Sulfo-NHS en identifiant le point qui a le rapport le plus élevé ou proche du plus élevé de signal positif / négatif. Dans ce calcul de ratio, considérez le faible signal de fond obtenu à partir des échantillons négatifs. NOTE: Les concentrations optimales de Ru Sulfo-NHS et de protéines antigéniques marquées à la biotine provenant des tests en damier sont indiquées ci-dessous: 30 ng / mL et 200 ng / mL pour GAD65, 120 ng / mL et 120 ng / mL pour la proinsuline, 10 ng / mL et 42 ng / mL pour IA-2, 80 ng / mL et 80 ng / mL pour TG, 8 ng / mL et 16 ng / mL pour TPO, 31 ng/mL et 31 ng/mL pour ThG, et 12 ng/mL et 12 ng/mL pour IFNα.</li>
</ol>4. Créer la solution d’antigène couplé à un agent de liaison mixte
<ol><li>Sélectionnez la concentration optimale pour chaque antigène en fonction du test en damier. Diluer l’antigène marqué biotine et Ru Sulfo-NHS à la concentration rationnelle de travail.</li>
	<li>Lier différents liants à chacune des protéines antigéniques biotinylées de manière unique. Pour un essai sur plaque à 96 puits, mélanger 4 μL de GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuline, protéine IFN-α et IA-2 biotinylée avec 240 μL de linker conjugué streptavidine 1, 2, 3, 4, 8, 9 et 10 dans un tube séparé (figure 1). Ajoutez ensuite 156 μL de PBS/1 % de BSA par tube. Incuber le mélange à température ambiante pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter 160 μL de solution stop dans chaque tube et les incuber à température ambiante pendant encore 30 min. Prélevez 400 μL d’antigène couplé à un agent de liaison de chaque tube et combinez les 7 antigènes ensemble. Ajouter 1,2 mL de solution stop, puis ajouter 4 μL de Ru Sulfo-NHS marqué GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsuline, IFN-α et antigène IA-2 au mélange. Maintenant, la solution antigénique est prête à être utilisée dans le test.</li>
</ol>5. Incuber les échantillons de sérum avec l’antigène marqué
REMARQUE: Étant donné que le test ECL-IAA de ce test 7-Plex nécessite un traitement acide des échantillons de sérum, chaque sérum nécessite l’étape de traitement acide avant d’être incubé avec un mélange d’antigènes marqué pour ce test 7-Plex.
<ol><li>Aliquote 15 μL de sérum par puits pour une plaque PCR à 96 puits. Ajouter 18 μL d’acide acétique 0,5 M dans chaque puits et mélanger. Incuber pendant 45 min à TA. Préparer une nouvelle plaque de PCR à 96 puits et aliquoter 35 μL de solution antigénique dans chaque puits.</li>
	<li>Pendant que la plaque est encore en incubation, ajouter 13 μL de tampon Tris pH 9,0 de 1 M à chaque puits de la plaque antigénique. Ajouter un tampon sur le côté de chaque puits pour limiter le mélange du tampon Tris et de l’antigène. Une fois l’incubation terminée, prenez 25 μL du sérum traité à l’acide et pipetez-le immédiatement dans chaque puits de la plaque antigénique. Agiter la solution et couvrir la plaque avec une feuille d’étanchéité PCR pour éviter l’exposition à la lumière.</li>
	<li>A la RT, poser la plaque sur un shaker, réglé à basse vitesse, pendant 1 h. Ensuite, conservez la plaque à 4 °C et laissez la plaque incuber pendant 18-24 h.</li>
</ol>6. Préparez la plaque multiplex
<ol><li>Prenez une plaque multiplex du réfrigérateur à 4 °C et laissez la plaque venir à RT. Une fois que la plaque multiplex est à RT, ajouter 150 μL de bloqueur A à 3 % à chaque puits. Couvrir la plaque multiplex d’une feuille d’étanchéité. Incuber la plaque dans un réfrigérateur à 4 °C pendant une nuit. REMARQUE : Le jour 1 du test comprend les étapes 4 à 6.</li>
</ol>7. Transférer les incubations de sérum/antigène dans la plaque multiplex
<ol><li>Le lendemain, placez des serviettes en papier sur la table et sortez l’assiette multiplex d’incubation du réfrigérateur. Videz toute la mémoire tampon de la plaque. Pour ce faire, retournez l’assiette et collez-la sur les serviettes en papier préparées jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de tampon dans aucun des puits.</li>
	<li>Lavez la plaque multiplex en ajoutant 150 μL de PBST dans chaque puits. Supprimez la mémoire tampon, comme mentionné à l’étape 7.1., et répétez cette étape trois fois. Ajouter 30 μL d’incubations de sérum/antigène dans chaque puits de la plaque multiplex. Couvrir la plaque de papier d’aluminium pour limiter son exposition à la lumière. Placer la plaque sur un agitateur à plaque, réglé à basse vitesse, à TA pendant 1 h.</li>
</ol>8. Lavez la plaque et ajoutez un tampon de lecture
<ol><li>Retirez le sérum/antigène incuber de la plaque multiplex en tenant la plaque à l’envers et en faisant sortir la solution. Ajouter 150 μL de PBST dans tous les puits et retirer le tampon de la plaque en tenant à nouveau la plaque à l’envers et en faisant sortir la solution. Répétez cette étape trois fois. Une fois le troisième lavage terminé, ajoutez 150 μL de tampon de lecture dans chaque puits. REMARQUE: Les bulles d’air interfèrent avec la capacité de la machine de lecture de plaques à analyser avec précision les résultats de la plaque et doivent être évitées à tout prix.</li>
</ol>9. Lire l’assiette et analyser les données
<ol><li>Comptez la plaque préparée sur la machine de lecture de plaques, en lisant toutes les valeurs en comptage par seconde (CPS).</li>
	<li>Calculer l’indice relatif pour le test, en utilisant les niveaux d’anticorps obtenus à partir de l’appareil de lecture de plaques, avec l’équation suivante: Valeur de l’indice = [CPS (échantillon) - CPS (norme négative)] / [CPS (norme positive) - CPS (norme négative)].</li>
	<li>Déterminer quels résultats d’anticorps sont négatifs ou positifs à l’aide des seuils qui ont été établis. REMARQUE : Le jour 2 du test comprend les étapes 7 à 9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+trends+in+the+incidence+of+type+1+diabetes+in+Finnish+children:+a+cohort+study.">Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study.</a> Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).</li><li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth.">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes.">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li><li>Insel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Barker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+"subspecificity"+in+type+1+diabetes:+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups.">Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li><li>Triolo, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Autoimmune+Disease+Found+in+33%+of+Patients+at+Type+1+Diabetes+Onset.">Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li><li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus.">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/Insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+(ECL)+Assay.">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Journal of Clinical &amp; Cellular Immunology. 8 (6), (2017).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescence+Assays+for+Human+Islet+Autoantibodies.">Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplexed+autoantibody+detection+to+screen+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases+simultaneously.">High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously.</a> Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).</li><li>Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescence+Assays+for+Insulin+and+Glutamic+Acid+Decarboxylase+Autoantibodies+Improve+Prediction+of+Type+1+Diabetes+Risk.">Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL-IAA+and+ECL-GADA+Can+Identify+High-Risk+Single+Autoantibody-Positive+Relatives+in+the+TrialNet+Pathway+to+Prevention+Study.">ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).</li><li>Fouts, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+Electrochemiluminescence+Assays+Improve+Prediction+of+Time+to+Type+1+Diabetes+in+Autoantibody-Positive+TrialNet+Subjects.">Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects.</a> Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).</li><li>Sosenko, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Electrochemiluminescence+Assays+to+Predict+Autoantibody+and+Glycemic+Progression+Toward+Type+1+Diabetes+in+Individuals+with+Single+Autoantibodies.">The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+Sensitivity+and+Earlier+Identification+of+Celiac+Disease+Autoimmunity+by+a+Nonradioactive+Assay+for+Transglutaminase+Autoantibodies.">Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).</li><li>Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasmonic+chip+for+biomarker+discovery+and+diagnosis+of+type+1+diabetes.">A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes.</a> Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).</li><li>Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+Antibody+Detection+by+Agglutination-PCR+(ADAP).">Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP).</a> American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).</li><li>Yim, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+alternating-laser+excitation+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+for+next-generation+biodetection+assays.">Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays.</a> Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).</li><li>Bale, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+microsphere-based+assay+for+early+detection+of+Type+I+diabetes.">A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes.</a> Technology. 02 (03), 200-205 (2014).</li><li>Ziegler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+Screen+ELISA+for+High-Throughput+Detection+of+Beta+Cell+Autoantibodies+in+Capillary+Blood.">3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li><li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Antibody+Standardization+Program:+evaluation+of+assays+for+insulin+autoantibodies.">Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies.</a> Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+combining+insulin,+GAD,+IA-2+and+transglutaminase+autoantibodies+to+facilitate+screening+for+pre-type+1+diabetes+and+celiac+disease.">A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans de nombreux essais cliniques nationaux et internationaux sur le diabète de type 1, l’efficacité du test ECL unique pour détecter les autoanticorps des îlots pancréatiques et les autoanticorps dirigés contre la transglutaminase (TGA) pour la maladie cœliaque a été confirmée 8,9,10,11. Tout au long de ces essais, ce test a augmenté la sensibilité et la spécificité pour la détection des autoantigènes lorsqu’il est évalué par rapport à la RBA de référence existante. La spécificité accrue de la maladie peut être observée lors de la distinction entre le test ECL unique et le test RBA14,15,16,17. En nous appuyant sur le test ECL unique, nous posons un nouveau test d’autoanticorps ECL multiplexé à haut débit, pour nous permettre de dépister le DT1 ainsi que plusieurs maladies auto-immunes applicables en même temps.
Le test ECL multiplex utilise la plaque multiplex, qui peut combiner jusqu’à 10 tests d’autoanticorps dans un seul puits. Pour la présente étude, 7 tests d’autoanticorps sont combinés. Les autoanticorps comprennent 3 IAbs (IAA, GADA et IA-2A), 2 autoanticorps auto-immuns contre la maladie thyroïdienne (TPOA et ThGA), des autoanticorps contre la maladie cœliaque (TGA) et des autoanticorps APS-1 contre l’interféron alpha (IFNαA). Le mécanisme de dosage est, en général, basé sur un seul test ECL tel que publié précédemment 9,10,12,18 avec quelques modifications. La principale différence entre un test ECL multiplex et un seul test ECL est que chaque complexe anticorps-antigène formé dans la phase fluide est limité à un agent de liaison spécifique (Figure 1). L’antigène marqué à la biotine est incubé avec la streptavidine conjuguée, un agent de liaison utilisé pour former un complexe antigène-liant spécifique. Le complexe immunitaire anticorps-antigène se forme après incubation avec le sérum du patient et est capturé sur un point spécifique par le système de liaison spécifique sur chaque puits de la plaque multiplex. L’antigène marqué Ru Sulfo-NHS capturé par les anticorps fournit en même temps le signal avec électrochimiluminescence. La machine de lecture de plaques peut détecter jusqu’à 10 signaux différents provenant des sources ponctuelles situées dans chaque puits. Pour maintenir la cohérence des tests d’autoanticorps entre les plaques et lors de la réalisation d’études à long terme, nous suggérons d’utiliser le même agent de liaison.
Avant de mettre en place un test ECL multiplex, les tests ECL uniques pour chaque autoanticorps doivent être optimisés sur une plaque multiplex, respectivement, et validés par rapport aux tests RBA et ECL uniques sur une plaque ECL régulière. Pour améliorer le test en damier, pour le test d’autoanticorps associé sur la plaque multiplex, un patient très positif et un échantillon de patient négatif ont été utilisés. Après le test en damier, les concentrations les plus idéales pour le Ru Sulfo-NHS et l’antigène marqué à la biotine ont été calculées pour chacun des 7 tests d’auto-anticorps. Voici ces concentrations : 30 ng/mL et 200 ng/mL pour GAD65, 120 ng/mL et 120 ng/mL pour la proinsuline, 10 ng/mL et 42 ng/mL pour l’IA-2, 80 ng/mL et 80 ng/mL pour la TG, 8 ng/mL et 16 ng/mL pour la TPO, 31 ng/mL et 31 ng/mL pour le ThG, et 12 ng/mL et 12 ng/mL respectivement pour l’IFNα13. Les concentrations de certains des antigènes du test en damier peuvent devoir être ajustées davantage en fonction des résultats de l’essai multiplex réel après avoir combiné tous les tests ensemble.
Comme l’AIA est inclus dans le présent test ECL multiplexe, le traitement acide des échantillons de sérum est obligatoire avant l’incubation du sérum avec l’antigène, comme indiqué dans l’étude précédente12. En règle générale, lorsqu’un autoanticorps supplémentaire est ajouté à un test multiplex, le fond du test est affecté et un signal extrêmement élevé provenant d’un endroit, dans le puits, peut obstruer les résultats des points voisins via la diaphonie. Par conséquent, le CPS maximal doit être limité à 20 000 comptes pour chaque autoanticorps, ou moins, pour les échantillons positifs les plus élevés. D’après nos connaissances, afin de réduire la quantité de diaphonie impliquée, les autoanticorps qui ont un arrière-plan inférieur doivent être séparés, lors de la conception de la carte ponctuelle, loin des points avec une fréquence plus élevée de comptage.
Des témoins positifs et négatifs élevés ont été utilisés à l’interne dans chaque essai pour calculer un indice précis pour les échantillons inconnus testés. Pour évaluer et surveiller avec précision la sensibilité du test, des témoins faiblement positifs, placés près de la limite supérieure du test, ont été utilisés. Ces témoins positifs et négatifs standard ont été créés en vrac et en partie aliquote pour une utilisation à long terme et stockés à -20 °C ou moins, pour assurer la cohérence entre les essais. À des fins d’assurance de la qualité, les échantillons ont été analysés deux fois dans chaque essai et chaque résultat positif a été répété et confirmé en exécutant l’échantillon dans un nouveau test ECL le lendemain. En cas de désaccord avec le premier et le deuxième test de confirmation, un troisième test était nécessaire. Sur les trois essais effectués, les résultats des deux essais qui concordent (p. ex., +, + ou -,-) ont déterminé le résultat final (positif ou négatif) de l’échantillon.
Au cours de la dernière décennie, de nombreux groupes d’étude ont cherché un test à haut débit utilisant la méthode multiplex pour combiner plusieurs tests d’autoanticorps en un seul puits pour dépister de grandes populations. Il existe quelques études qui utilisent différents types de technologies pour effectuer des tests d’autoanticorps multiplex 19,20,21,22, mais il n’y a aucune comparaison pour aucun de ces tests de sensibilité et de spécificité avec l’étalon-or RBA actuel, lors de l’étude du DT1. Ces différents types de plateformes utilisées ne sont pas validés par l’atelier international du Programme de normalisation des autoanticorps des îlots pancréatiques (IASP) ou par l’essai de grandes cohortes dans le cadre d’essais cliniques. Dans un récent dépistage basé sur la population générale en Allemagne, un test combiné à haut débit, 3 Screen ICATM ELISA distribué par Kronus, est utilisé comme outil de dépistage de première intention pour détecter trois IAbs, GADA, IA-2A et ZnT8A, afin d’obtenir un diagnostic précoce du DT123 chez l’enfant. Le test ELISA à 3 écrans mesure 3 auto-anticorps soit dans 3 puits séparés, consommant un grand volume de sérum, soit dans un seul puits avec les 3 tests mélangés. Si un puits dans le test ELISA à 3 écrans est positif, on est incapable de distinguer lequel des trois autoanticorps est présent. Le plus grand inconvénient de ce test est son incapacité à inclure la mesure de l’IAA. Tous les résultats de l’AIA réalisés par ELISA, comme l’ont prouvé les ateliers de l’IASP, n’ont pas une sensibilité et une spécificité acceptables24. L’IAA est généralement le premier IAb à apparaître et a une prévalence élevée chez les jeunes enfants. Le dépistage IAb, avec IAA, est nécessaire pour les enfants et il n’est pas jugé acceptable d’effectuer ce dépistage sans IAA pour évaluer le risque de DT1 dans la communauté. En outre, il n’y a pas d’études ou de données publiées qui montrent que le test Kronus IAb kit est plus spécifique à la maladie T1 et capable de distinguer le risque élevé de l’IAbs à faible risque. Le test ECL 7-Plex, dans la présente étude, a été validé à l’aide d’une grande cohorte de patients nouvellement diagnostiqués avec leDT11 13. Comparé à la RBA standard actuelle et au test ECL unique bien établi, le test 7-Plex est capable de conserver une positivité de 100% avec la même spécificité de test (tableau 4). Actuellement, le test ECL 4-Plex, parallèle à la RBA standard, est appliqué à un vaste essai clinique en cours: Autoimmunity Screening for Kids (ASK). Cet essai examine le DT1 et la maladie cœliaque chez les enfants de la population générale de la région métropolitaine de Denver. Par rapport à la RBA standard utilisée dans l’étude ASK, le test ECL multiplex montre une excellente sensibilité et une spécificité de la maladie plus élevée, identique à nos rapports précédents utilisant l’étude ECL unique25. De plus, notre test ECL 4-Plex a démontré une réduction prononcée de la main-d’œuvre, du coût et du volume sérique de 70%, par rapport aux 4 tests uniques correspondants pour ECL et RBA. En utilisant le test ECL multiplexé, nous pouvons personnaliser chaque puits avec différents nombres, représentant différents autoanticorps (jusqu’à 10), pour tester différentes maladies auto-immunes spécifiques aux besoins d’un emplacement clinique particulier.
Certaines limites ont été observées, démontrées dans la présente étude, pour un essai ECL multiplexé utilisant la plaque multiplex. La dilution finale du sérum, incubé avec de l’antigène, ne peut pas être ajustée pour obtenir les conditions les plus optimales pour chaque essai d’autoanticorps combiné dans un seul puits. Neuf échantillons (9/1026), provenant de patients atteints de DT1, ont été observés pour avoir un résultat faussement négatif pour des autoanticorps particuliers. 7 des faux négatifs concernaient la TPOA et 2 la ThGA, dans le test ECL 7-Plex, mais des résultats positifs élevés ont été observés à la fois dans le test ECL unique et dans la RBA (figures 2 et 3). Après une nouvelle dilution des 9 échantillons, ils sont devenus positifs sur la plaque multiplex. Ce résultat est causé par ce que nous décrivons comme le phénomène de « prozone ». Ce phénomène fait que l’échantillon affiche un résultat faussement négatif parce que les titres élevés d’anticorps affectent la formation de réseaux antigène-anticorps. Lors de la mise en place d’un test multiplex, il est recommandé d’effectuer des pré-tests pour déterminer la dilution facultative du sérum pour l’incubation de l’antigène. Alternativement, des tests d’autoanticorps avec des conditions optimisées similaires doivent être sélectionnés pour former un test combiné à partir duquel la meilleure sensibilité et spécificité du test est obtenue pour chaque autoanticorps. Dans la présente étude, 7 échantillons (7/1022), provenant de témoins normaux sains, ont donné de faux positifs pour plusieurs autoanticorps dans le test 7-Plex, mais après avoir effectué un seul test ECL et RBA (Figure 2 & 3), ces autoanticorps se sont révélés négatifs dans les deux essais. Les raisons de ces résultats faussement positifs sur la plaque multiplex, pour ce petit sous-ensemble d’échantillons, sont actuellement inconnues. Pour l’application actuelle du test ECL multiplexe, tous les échantillons positifs sont répétés avec leur test ECL unique correspondant pour confirmer la positivité, ce qui élimine cette erreur faussement positive du test ECL multiplexe.

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie chronique grave qui est plus fréquente dans l’enfance. À l’heure actuelle, environ 1,4 million de personnes ont le DT1 aux États-Unis; Il est frappant de constater que l’incidence du DT1 augmente régulièrement de 3 à 5 % chaque année dans le monde et a doublé au cours des deux dernières décennies, en particulier chez les jeunes enfants[1,2]. Les autoanticorps des îlots pancréatiques (IAbs) dans la circulation sanguine sont le biomarqueur le plus fiable à l’heure actuelle. L’IAbs peut apparaître des années avant que le DT1 clinique ne se développe3. Actuellement, quatre IAbs majeurs sont largement utilisés dans le diagnostic du DT1 et le dépistage des risques, notamment les autoanticorps dirigés contre l’insuline (IAA), la glutamate décarboxylase-65 (GADA), l’antigène 2 de l’insulinome (IA-2A) et le transporteur de zinc 8 (ZnT8A). Ces quatre IAb sont tout aussi importants dans la prédiction du développement du DT1. La classification du DT1 a été redéfinie récemment comme la présence de ≥2 de 4 IAbs avec un métabolisme normal du glucose comme stade 14 de la maladie.
Dans l’étude DAISY (Diabetes Autoimmunity Study in the Young), il a été révélé qu’un enfant sur quatre à risque de DT1 était susceptible de progresser vers une auto-immunité des îlots, des cœliaques, de la thyroïde ou des rhumatoïdes et, plus frappant encore, environ 40% des patients ayant reçu un diagnostic de DT1 finissent par développer une maladie auto-immune supplémentaire 5,6,7 . L’identification des autoanticorps est essentielle pour la prédiction et le diagnostic de ces maladies auto-immunes et devrait fournir de meilleurs soins cliniques aux patients. Il n’existe actuellement aucun moyen facile et peu coûteux de dépister ces multiples maladies auto-immunes. Les méthodes de dépistage actuelles utilisant un test de liaison radio (RBA) standard, avec une seule mesure d’auto-anticorps, sont laborieuses et inefficaces pour un dépistage à grande échelle.
Ici, nous décrirons le nouveau test ECL multiplexé simple, que nous avons authentifié à l’aide d’une seule plate-forme de test ECL 8,9,10,11. Le test ECL multiplex combine 7 tests d’autoanticorps dans un seul puits, utilisant seulement 15 μL de sérum, et est capable de dépister simultanément le DT1 et plusieurs maladies auto-immunes pertinentes, y compris la maladie cœliaque, la maladie thyroïdienne auto-immune et l’APS-1. Un test ECL ZnT8A n’avait pas été développé à l’époque et n’a pas été inclus dans le test multiplexé. Le test ECL multiplex fournit un excellent outil pour le dépistage à haut débit dans la population générale pour le DT1 et les maladies auto-immunes multiples.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8211;80 &#176;C and -20 &#176;C freezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>Wallac - Delfi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GAD65 full length protein</td>
			<td>Diamyd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ThG full length protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO full length protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 intracellular domain protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#945; protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>DiaRect</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 mL , Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A or B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled deionized (DD) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice maker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Sector</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tower</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette-Aid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes/tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ru Sulfo-NHS</td>
			<td>MSD (R91AN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uplex Development Kit</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well UPlex plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linker-Streptavidin</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R92TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>89892</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases

Les autoanticorps des îlots pancréatiques (IAbs) sont largement utilisés dans le diagnostic et la prédiction du diabète de type 1 (DT1). Quatre IAbs majeurs à l’insuline (IAA), la glutamate décarboxylase-65 (GADA), l’antigène 2 de l’insulinome (IA-2A) et le transporteur de zinc 8 (ZnT8A) sont tout aussi importants dans la prédiction de la maladie. À l’heure actuelle, jusqu’à 40 % des patients diagnostiqués avec le DT1 développent d’autres maladies auto-immunes. Malheureusement, les méthodes de dépistage actuelles utilisant un seul autoanticorps pour la mesure sont laborieuses et inefficaces pour les études de dépistage à grande échelle. Nous avons récemment développé un test simple d’électrochimiluminescence multiplexée (ECL) pour résoudre ces problèmes actuels. Le test combine les 7 tests d’autoanticorps dans un seul puits. Chaque puits comprend trois IAbs (IAA, GADA et IA-2A), des autoanticorps dirigés contre la peroxydase thyroïdienne (TPOA) et la thyroglobuline (ThGA) pour détecter les maladies thyroïdiennes auto-immunes, des autoanticorps dirigés contre la transglutaminase tissulaire (TGA) pour la maladie cœliaque et des autoanticorps dirigés contre l’interféron alpha (IFNαA) pour le syndrome polyglandulaire auto-immun-1 (APS-1); qui dépister simultanément le DT1 et d’autres maladies auto-immunes pertinentes. Le test ECL multiplex est basé sur la plate-forme de dosage ECL unique, mais utilise plutôt la plaque multiplex combinant plusieurs tests d’auto-anticorps, jusqu’à 10, dans un seul puits. La principale différence par rapport au test ECL unique est que chaque complexe anticorps-antigène formé dans la phase fluide est retenu sur un point spécifique de chaque puits par un système de liaison sur la plaque multiplex. Le test ECL 7-Plex, dans la présente étude, est validé par rapport aux tests de liaison radio (RBA) standard et aux tests ECL uniques, en utilisant une grande cohorte de patients atteints de DT1 nouvellement diagnostiqués et de témoins sains appariés selon l’âge, ce qui donne une excellente sensibilité et spécificité du test.

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases at JoVE.com

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Nous modélisons un test ECL multiplexé simple qui combine 7 tests d’auto-anticorps. Le test est capable de dépister le DT1 et plusieurs autres maladies auto-immunes, simultanément, y compris la maladie cœliaque, la maladie thyroïdienne auto-immune et le syndrome polyglandulaire auto-immun 1.

Un test électrochimiluminescence 7-plex à haut débit dépistant simultanément le diabète de type 1 et de multiples maladies auto-immunes

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate ...

a-high-throughput-electrochemiluminescence-7-plex-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

2.3K vues.  University of Colorado School of Medicine. Nous modélisons un test ECL multiplexé simple qui combine 7 tests d’auto-anticorps. Le test est capable de dépister le DT1 et plusieurs autres maladies auto-immunes, simultanément, y compris la maladie cœliaque, la maladie thyroïdienne auto-immune et le syndrome polyglandulaire auto-immun 1.

Vidéo: A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

L&#39;énucléation des yeux de souris à distance pour le phénotypage à haut débit

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Recherche

Médecine

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long. 
	There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
	High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS. 
	HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility. 
	Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21. 
	Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

We describe a methodology combining automated cell culturing with high-content imaging to visualize and quantify multiple cellular processes and structures, in a high-throughput manner. Such methods can aid in the further functional annotation of genomes as well as identify disease gene networks and potential drug targets.

Dépistage du contenu haute sur les maladies neurodégénératives

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Un procédé de précipitation modification pour isoler les exosomes urinaire

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un système organotypiques à haut débit pour la caractérisation de la sensibilité des médicaments cellules du myélome multiple primaire

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes an artificial small guide RNA (sgRNA) to guide tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease, tRNase ZL, to recognize a target RNA. sgRNAs can be taken up by cells without any transfection reagents and can downregulate their target RNA levels and/or induce apoptosis in human cancer cells. We have screened an sgRNA library containing 156 heptamer-type sgRNAs for the effect on viability of human myeloma and leukemia cells, and found that 20 of them can efficiently induce apoptosis in at least one of the cancer cell lines. Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers. The protocol includes how to construct the sgRNA library, how to assess the effect of each sgRNA on cell viability, and how to further evaluate the effective sgRNAs by flow cytometry. Around 2,000 hits would be expected to be obtained by screening the full-scale sgRNA library composed of 16,384 heptamers.

Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers.

TRUE Gene Silencing: Projection d&#39;un heptamère type Petit Guide ARN Bibliothèque pour les agents thérapeutiques potentiels du cancer

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, multiplexée et ciblée protéomique CSF Assay à Quantifier neurodégénératifs Biomarqueurs et apolipoprotéine E isoformes Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Haut-débit Nitrobenzoxadiazole marqué cholestérol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay formats are currently in use worldwide so there is a need for an accurate and high-throughput method for measuring RSV NAbs. We describe here an imaging-based micro-neutralization assay that has been tested on RSV subgroup A and can also be adapted for RSV subgroup B and different sample types. This method is highly reproducible, with inter-assay variations for the reference antiserum being less than 10%. We believe this assay can be readily established in many laboratories worldwide at relatively low cost. Development of an improved, high-throughput assay that measures RSV NAbs represents a significant step forward for the standardization of this method internationally as well as being critical for the evaluation of novel RSV vaccine candidates in the future.

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

This study describes a high throughput, imaging-based micro-neutralization assay to determine the titer of neutralizing antibodies specific for respiratory syncytial virus (RSV). This assay format has been tested on different sample types.

Un test de Micro-neutralisation du Virus respiratoire Syncytial (VRS) amélioré et haut débit

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Analyse à haut débit des données de cartographie optique à l'aide d'ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

Une méthode in situ à haut débit pour l’estimation de la ploidy nucléaire hépatocyte chez les souris

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...