이 작업은 NIH 보조금 DK32083, JDRF 보조금 2-SRA-2015-51-Q-R 및 2-SRA-2018-533-S-B의 지원을 받았습니다.

연구 프로토콜은 콜로라도 다중 기관 검토위원회의 승인을 받았습니다.
1. 완충액 준비
<ol><li>라벨링 완충액(2x PBS, pH 7.9)을 만든다. 400mL의 증류된 탈이온수(DD)를 사용하여 100mL의 10x PBS를 추가합니다. 용액의 pH를 조정하려면 7.9에 도달 할 때까지 NaOH를 첨가하십시오.</li>
	<li>이전에 생성된 588μL의 라벨링 버퍼에 1mg의 비오틴을 용해시켜 3mM 비오틴을 만듭니다. 150 nmol의 Ru 설포-NHS를 50 μL의 표지 완충액에 용해시켜 3 mM Ru 설포-NHS를 만든다.</li>
	<li>500mL의 1x PBS를 취하여 5g의 소 혈청 알부민(BSA)을 용액에 첨가하여 항원 완충액(1% BSA)을 만듭니다. 0.5M의 아세트산 용액을 준비하십시오. 트리즈마 염기를 사용하여 1 M 트리스-HCl 완충액을 준비하고 pH를 9.0으로 조정하였다.</li>
	<li>코팅 완충액(3% 블로커 A)의 경우, 500mL의 1x PBS를 취하고, 15g의 블로커 A를 첨가하고, 5000mL의 1x PBS를 2.5mL의 트윈 20과 혼합하여 세척 완충액(0.05% 트윈 20, PBST)을 준비한다. 500mL의 DD 물과 500mL의 4x 읽기 버퍼 T를 계면활성제와 함께 추가하여 판독 버퍼(계면활성제가 있는 2x 판독 버퍼 T)를 생성합니다. 참고: 분석 간의 일관성을 유지하려면 비오틴과 Ru Sulfo-NHS 용액을 라벨링 절차 직전에 생성하고 향후 사용을 위해 생성 및 저장하지 않는 것이 중요합니다.</li>
</ol>2. 각 항원 단백질에 비오틴과 Ru 설포-NHS를 별도로 표지
참고: 보다 효과적인 라벨링 반응을 위해서는 ≥0.5mg/mL의 항원 단백질 농도를 사용하십시오.
<ol><li>각 항원 단백질의 몰수와 비오틴 및 Ru 설포-NHS의 몰수를 계산한다. 항원 단백질과 비오틴 또는 Ru Sulfo-NHS의 몰비에 따른 표지 반응을 위해 항원 단백질에 적당량의 비오틴 또는 Ru Sulfo-NHS를 첨가한다.<ol><li>프로 인슐린 단백질과 같이 분자량이 작은 항원 (≤10 kDa)의 경우 1 : 5의 몰비를 사용하십시오 (항원 : 비오틴 및 Ru Sulfo-NHS). GAD 단백질과 같이 분자량이 더 큰 항원(>50kDa)의 경우 1:20의 몰비를 사용하십시오. 중간 분자량 (10-50 kDa)을 갖는 항원의 경우 1 : 5-1 : 20 사이에서 조정 된 몰비를 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>비오틴과 Ru Sulfo-NHS 모두에 대해 각 항원 중량을 해당 분자량으로 나누어 각각에 대한 항원 몰수를 얻습니다. 몰수를 농도로 나누어 비오틴의 부피를 구합니다. Ru Sulfo-NHS에 대해 이것을 반복하십시오.</li>
	<li>단계 2.2에서 결정된 적절한 몰비를 사용하여 항원 단백질을 비오틴과 혼합합니다. 그런 다음 Ru Sulfo-NHS에 대해서도 동일한 작업을 수행하십시오. 참고: 라벨링 반응의 효율성을 위해 버퍼 시스템의 트리스 또는 글리신과 같은 환원 화학 물질은 사이징 스핀 컬럼에 의해 2x PBS 버퍼(pH 7.9)로 교환해야 합니다. 비오틴과 Ru Sulfo-NHS에 대한 라벨링 프로토콜은 동일합니다.</li>
	<li>반응 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다. 반응 튜브를 호일로 덮는 이유는 비오틴과 Ru Sulfo-NHS 시약이 모두 빛에 민감하기 때문입니다.</li>
	<li>반응 튜브가 배양되는 동안 2mL 또는 5mL 스핀 컬럼을 프라이밍합니다(스핀 컬럼의 크기는 컬럼에 업로드된 부피에 따라 결정됨). 스핀 컬럼을 2x PBS 버퍼로 채운 다음 매번 1,000 x g 에서 2분 동안 총 3회 원심분리합니다.</li>
	<li>반응 튜브가 배양을 마친 후 라벨링 반응을 중지하십시오. 반응을 멈추려면 표지된 항원 단백질을 스핀 컬럼에 한 번 통과시켜 정제합니다. 그런 다음 컬럼을 1,000 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>존재하는 항원 단백질의 양을 최종 부피로 나누어 총 표지된 항원 농도를 계산합니다. 정제된 표지된 항원 단백질을 튜브 당 50 μL의 분취량 및 장기간 사용을 위해 -80°C에서 분취량을 보관한다. 참고: 스핀 컬럼이 항원 단백질을 통과할 때마다 약 90-95%의 보유율이 있다는 점을 인식하는 것이 중요합니다.</li>
</ol>3. 분석(바둑판 분석)을 위해 두 개의 표지된 항원에 대한 최상의 농도와 비율을 정의합니다.
참고: 이 7-Plex 분석의 ECL-IAA 분석은 혈청 샘플의 산 처리가 필요하므로 각 항원에 대한 바둑판 분석은 표지된 항원 혼합물과 함께 배양하기 전에 이 단계를 거쳐야 합니다.
<ol><li>멀티플렉스 분석을 실행하기 전에 각 항원에 대해 개별적으로 바둑판 분석을 적용하십시오. 3.2-3.6단계에서는 GAD65를 예로 사용합니다.</li>
	<li>표지된 GAD65 단백질의 희석을 계산합니다. 비오틴화 GAD65의 첫 번째 혼합 용액의 권장 목표 농도는 2000 ng / mL이고 Ru 설포 -NHS 표지 GAD65는 1000 ng / mL입니다. 저장 용액에서 비오티닐화 및 Ru 설포-NHS 표지 GAD65의 농도가 모두 1.0μg/μL인 경우, 작업 용액 560μL에서 비오틴화 GAD65에 필요한 부피는 1.12μL가 되고 700μL의 작업 용액에서 Ru 설포-NHS 표지 GAD65에 필요한 부피는 0.7μL가 됩니다.</li>
	<li>1.12μL의 비오틴화 GAD65 단백질과 240μL의 스트렙타비딘 접합 링커 1을 하나의 튜브에 혼합하고 160μL의 1% BSA를 혼합합니다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양한다. 160μL의 정지 용액을 튜브에 첨가하고 혼합물을 실온에서 30분 더 배양합니다.</li>
	<li>연속 희석을하십시오. 혼합물 280μL를 새 튜브에 넣고 정지액 280μL를 추가하여 1:2 희석액을 만듭니다. 몇 개의 새로운 튜브를 준비하십시오. 이 단계를 반복하여 비오틴 표지된 GAD65 항원에 대해 수평 연속 희석을 실행합니다(이전 간행물12 참조).</li>
	<li>0.7μL의 Ru 설포-NHS 표지 GAD65(1μg/μL) 단백질을 700μL의 정지 용액과 혼합합니다. 그런 다음 혼합물 350μL를 새 튜브에 넣고 정지 용액 350μL를 추가하여 1:2 희석액을 만듭니다. 몇 개의 새로운 튜브를 준비하고이 단계를 반복하여 Ru Sulfo-NHS 표지 GAD65 항원에 대한 수직 직렬 희석을 실행합니다.</li>
	<li>두 개의 혈청 샘플을 준비하는데, 하나는 GADA에 대해 매우 양성이고 다른 하나는 GADA에 대해 음성이며 각각 부피가 0.75mL입니다. 15 μL의 양성 혈청을 96-웰 PCR 플레이트의 왼쪽 절반에 있는 모든 웰에 분취한다. 음성 혈청 15μL를 96-웰 PCR 플레이트의 오른쪽 절반에 있는 모든 웰에 분취합니다.</li>
	<li>각 웰에 0.5M 아세트산 18μL를 넣고 혼합합니다. RT에서 45분 동안 배양합니다. 새로운 96-웰 PCR 플레이트를 준비합니다. 17.5 μL의 비오틴 표지된 항원 및 17.5 μL의 Ru Sulfo-NHS 표지된 항원을 연속 희석에 따라 각각의 웰에 첨가한다 (이전 간행물12 참조).</li>
	<li>5.2단계 내지 9.1단계에 설명된 나머지 분석 단계를 계속한다.</li>
	<li>해당 음의 샘플 신호에 대한 높은 양성 샘플의 신호 비율을 결정합니다. 비오틴 표지 항원과 Ru Sulfo-NHS 표지 항원에 대해 가장 높은 농도를 선택하여 양성 대 음성 신호의 비율이 가장 높거나 가장 높은 지점을 확인한다. 이 비율 계산에서는 음성 샘플에서 얻은 낮은 배경 신호를 고려하십시오. 참고 : 바둑판 분석에서 Ru Sulfo-NHS 및 비오틴 표지 항원 단백질의 최적 농도는 다음과 같습니다 : GAD65의 경우 30 ng / mL 및 200 ng / mL, 프로 인슐린의 경우 120 ng / mL 및 120 ng / mL, IA-10의 경우 42 ng / mL 및 2 ng / mL, TG의 경우 80 ng / mL 및 80 ng / mL, TPO의 경우 8 ng / mL 및 16 ng / mL, ThG의 경우 31 ng / mL 및 31 ng / mL, IFNα의 경우 12 ng / mL 및 12 ng / mL입니다.</li>
</ol>4. 혼합 링커 결합 항원 용액 만들기
<ol><li>바둑판 분석을 기반으로 각 항원에 대한 최적의 농도를 선택하십시오. 비오틴과 Ru Sulfo-NHS 표지 항원을 합리적인 작업 농도로 희석합니다.</li>
	<li>서로 다른 링커를 각각의 고유하게 비오틴화된 항원 단백질에 결합시킨다. 하나의 96웰 플레이트 분석의 경우, 4μL의 비오티닐화 GAD65, TPO, tTG, ThG, 프로인슐린, IFN-α 및 IA-2 단백질과 240μL의 스트렙타비딘 접합 링커 1, 2, 3, 4, 8, 9 및 10을 별도의 튜브에 혼합합니다(그림 1). 그런 다음 튜브당 156μL의 PBS/1% BSA를 추가합니다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 배양한다.</li>
	<li>각 튜브에 160μL의 정지 용액을 넣고 실온에서 30분 더 배양합니다. 각 튜브에서 링커 결합 항원 400μL를 취하여 7개의 항원을 모두 결합합니다. 1.2mL의 정지 용액을 첨가한 다음 4μL의 Ru 설포-NHS 표지 GAD65, TPO, tTG, ThG, 프로인슐린, IFN-α 및 IA-2 항원을 혼합물에 첨가합니다. 이제 항원 용액을 분석에 사용할 준비가되었습니다.</li>
</ol>5. 표지된 항원으로 혈청 샘플 배양
참고: 이 7-Plex 분석의 ECL-IAA 분석에는 혈청 샘플의 산 처리가 필요하므로 각 혈청은 이 7-Plex 분석을 위해 표지된 항원 혼합물과 함께 배양하기 전에 산 처리 단계가 필요합니다.
<ol><li>96-웰 PCR 플레이트에 대해 웰당 혈청 15μL를 분취한다. 각 웰에 0.5M 아세트산 18μL를 넣고 혼합합니다. RT에서 45분 동안 배양합니다. 새로운 96-웰 PCR 플레이트를 준비하고 35μL의 항원 용액을 각 웰에 분취합니다.</li>
	<li>플레이트가 여전히 배양되는 동안, 항원 플레이트의 모든 웰에 1 M Tris pH 9.0 완충액 13 μL를 추가합니다. 트리스 완충액과 항원의 혼합을 제한하기 위해 각 웰의 측면에 완충액을 추가합니다. 배양이 완료된 후, 산 처리된 혈청 25 μL를 취하고, 즉시 항원 플레이트의 모든 웰에 피펫팅한다. 용액 교반 및 PCR 밀봉 호일로 플레이트를 덮어 빛 노출을 피하십시오.</li>
	<li>RT에서 플레이트를 저속으로 설정된 셰이커에 1 시간 동안 놓습니다. 그 후, 플레이트를 4°C에서 보관하고 플레이트를 18-24시간 동안 배양하도록 합니다.</li>
</ol>6. 멀티플렉스 플레이트 준비
<ol><li>4 ° C 냉장고에서 멀티 플렉스 플레이트를 가져 와서 플레이트가 RT가되도록합니다. 멀티플렉스 플레이트가 RT에 도달하면 각 웰에 150μL의 3% 차단제 A를 추가합니다. 멀티 플렉스 플레이트를 밀봉 호일로 덮으십시오. 플레이트를 4°C 냉장고에서 밤새 배양합니다. 참고: 분석 1일차에는 4단계부터 6단계까지 포함됩니다.</li>
</ol>7. 혈청/항원 배양물을 멀티플렉스 플레이트로 옮깁니다.
<ol><li>다음날 테이블 위에 종이 타월을 놓고 냉장고에서 인큐베이팅 멀티 플렉스 플레이트를 꺼냅니다. 플레이트에서 모든 버퍼를 비웁니다. 이렇게하려면 접시를 거꾸로 뒤집어 우물에 완충액이 없을 때까지 준비된 종이 타월에 가볍게 두 드리십시오.</li>
	<li>모든 웰에 PBST 150μL를 추가하여 멀티플렉스 플레이트를 세척합니다. 단계 7.1.에서 언급한 대로 버퍼를 폐기하고 이 단계를 세 번 반복합니다. 30μL의 혈청/항원 배양물을 멀티플렉스 플레이트의 모든 웰에 추가합니다. 빛에 대한 노출을 제한하기 위해 호일로 판을 덮으십시오. 플레이트를 저속으로 설정된 플레이트 셰이커에 놓고 RT에서 1시간 동안 놓습니다.</li>
</ol>8. 접시를 씻고 읽기 버퍼를 추가하십시오.
<ol><li>플레이트를 거꾸로 잡고 용액을 튕겨서 멀티플렉스 플레이트에서 혈청/항원 배양물을 제거합니다. 150μL의 PBST를 모든 웰에 추가하고 플레이트를 다시 거꾸로 잡고 용액을 튕겨서 플레이트에서 버퍼를 제거합니다. 이 단계를 세 번 반복합니다. 세 번째 세척이 완료된 후 각 웰에 150μL의 판독 버퍼를 추가합니다. 알림: 기포는 플레이트 리더 기계가 플레이트 결과를 정확하게 분석하는 기능을 방해하므로 어떤 대가를 치르더라도 피해야 합니다.</li>
</ol>9. 플레이트 읽기 및 데이터 분석
<ol><li>플레이트 리더 기계에서 준비된 플레이트를 세고 모든 값을 초당 카운트 (CPS)로 읽습니다.</li>
	<li>플레이트 리더 기계에서 얻은 항체 수준을 사용하여 다음 방정식으로 분석에 대한 상대 지수를 계산합니다. 인덱스 값 = [CPS (샘플) - CPS (네거티브 표준)] / [CPS (포지티브 표준) - CPS (네거티브 표준)].</li>
	<li>확립된 컷오프를 사용하여 어떤 항체 결과가 음성 또는 양성인지 확인합니다. 참고: 분석 2일차에는 7단계부터 9단계까지 포함됩니다.</li>
</ol>

<ol>
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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+Screen+ELISA+for+High-Throughput+Detection+of+Beta+Cell+Autoantibodies+in+Capillary+Blood.">3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li><li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Antibody+Standardization+Program:+evaluation+of+assays+for+insulin+autoantibodies.">Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies.</a> Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+combining+insulin,+GAD,+IA-2+and+transglutaminase+autoantibodies+to+facilitate+screening+for+pre-type+1+diabetes+and+celiac+disease.">A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

제 1 형 당뇨병에 대한 수많은 국내 및 국제 임상 시험에서 체강 질병에 대한 췌도자가 항체 및 트랜스 글루타미나 제 (TGA)에 대한자가 항체를 검출하기위한 단일 ECL 분석의 성능이 입증되었습니다 8,9,10,11. 이러한 추적 전반에 걸쳐 이 분석은 기존 '금' 표준 RBA에 대해 평가할 때 자가항원 검출에 대한 민감도와 특이성을 증가시켰습니다. 향상된 질환 특이성은 단일 ECL 분석과 RBA14,15,16,17 사이에서 고친화성 및 고위험 췌도 자가항체를 저위험, 저친화성 신호로부터 구별할 때 볼 수 있습니다. 단일 ECL 분석을 기반으로 새로운 고처리량 다중 ECL 자가항체 분석을 통해 T1D 및 여러 적용 가능한 자가면역 질환을 동시에 스크리닝할 수 있습니다.
멀티플렉스 ECL 분석은 최대 10개의 자가항체 어세이를 하나의 웰로 결합할 수 있는 멀티플렉스 플레이트를 사용합니다. 본 연구를 위해, 7개의 자가항체 분석법이 함께 결합된다. 자가항체는 3개의 IAb(IAA, GADA 및 IA-2A), 2개의 자가면역 갑상선질환 자가항체(TPOA 및 ThGA), 체강 질병 자가항체(TGA) 및 인터페론 알파에 대한 APS-1 자가항체(IFNαA)로 구성됩니다. 분석 메카니즘은, 일반적으로, 일부 변형된 9,10,12,18에 공개된 바와 같은 단일 ECL 분석에 기초한다. 단일 ECL 분석과 다중 ECL 분석의 주요 차이점은 유체상에 형성된 각 항체-항원 복합체가 특정 링커로 제한된다는 것입니다(그림 1). 비오틴 표지된 항원은 스트렙타비딘 컨쥬게이트와 함께 배양되며, 링커는 특정 항원-링커 복합체를 형성하는데 사용된다. 항체-항원 면역 복합체는 환자 혈청과 함께 배양한 후 형성되고 멀티플렉스 플레이트의 각 웰 상의 특이적 링커 시스템을 통해 특정 스팟 상에 포획된다. 동시에 항체에 의해 포획된 Ru 설포-NHS 표지된 항원은 전기화학발광으로 신호를 제공한다. 플레이트 리더 기계는 각 우물에 위치한 스팟 소스에서 최대 10개의 서로 다른 신호를 감지할 수 있습니다. 플레이트 간에 그리고 장기 연구를 수행하는 동안 자가항체 분석을 일관되게 유지하려면 동일한 링커를 사용하는 것이 좋습니다.
멀티플렉스 ECL 분석을 설정하기 전에 각 자가항체에 대한 단일 ECL 분석을 멀티플렉스 플레이트에 각각 최적화하고 일반 ECL 플레이트에서 RBA 및 단일 ECL 분석 모두에 대해 검증해야 합니다. 바둑판 분석을 향상시키기 위해, 멀티플렉스 플레이트 상의 관련 자가항체 분석에, 고양성 환자 및 음성 환자 샘플을 사용하였다. 바둑판 분석이 수행된 후, Ru 설포-NHS 및 비오틴 표지된 항원에 대한 가장 이상적인 농도를 7개의 자가항체 분석 각각에 대해 계산하였다. 다음은 이러한 농도를 보여줍니다 : GAD65의 경우 30 ng / mL 및 200 ng / mL, 프로 인슐린의 경우 120 ng / mL 및 120 ng / mL, IA-10의 경우 42 ng / mL 및 2 ng / mL, TG의 경우 80 ng / mL 및 80 ng / mL, TPO의 경우 8 ng / mL 및 16 ng / mL, ThG의 경우 31 ng / mL 및 31 ng / mL, IFNα13에 대해 각각 12ng/mL 및 12ng/mL입니다. 바둑판 분석으로부터의 일부 항원의 농도는 모든 분석을 함께 결합한 후 실제 다중 분석의 결과에 따라 추가로 조정되어야 할 수도 있다.
IAA가 본 멀티플렉스 ECL 분석에 포함됨에 따라, 이전 연구12에서 보고된 바와 같이, 혈청을 항원과 함께 배양하기 전에 혈청 샘플의 산 처리가 필수적이다. 일반적으로 추가 자가항체가 멀티플렉스 분석에 추가되면 분석 배경이 영향을 받고 웰의 한 지점에서 매우 높은 신호가 누화를 통해 주변 지점의 결과를 방해할 수 있습니다. 따라서, 최대 CPS는 각 자가항체에 대해 20,000 카운트로 제한되거나, 가장 높은 양성 샘플에 대해 더 낮게 제한될 필요가 있다. 우리가 아는 바에 따르면, 관련된 누화의 양을 줄이기 위해 스팟 맵을 설계할 때 카운트 빈도가 높은 스팟에서 배경이 낮은 자가항체를 분리해야 합니다.
높은 양성 및 음성 대조군은 테스트 중인 알려지지 않은 샘플에 대한 정확한 지수를 계산하기 위해 모든 분석에서 내부적으로 사용되었습니다. 분석의 민감도를 정확하게 평가하고 모니터링하기 위해 분석의 상한에 가깝게 설정된 낮은 양성 대조군이 사용되었습니다. 이러한 표준 양성 및 음성 대조군은 장기간 사용을 위해 벌크 및 분취량으로 생성되었으며 분석 간의 일관성을 위해 -20°C 이하에서 보관되었습니다. 품질 보증을 위해 모든 분석에서 샘플을 두 번 실행하고 모든 양성 결과를 다시 실행하여 다음날 새로운 ECL 분석에서 샘플을 실행하여 확인했습니다. 첫 번째 및 두 번째 확인 분석에 불일치가 있는 경우 세 번째 분석이 필요했습니다. 수행된 3개의 분석 중, 2개의 분석의 결과(예를 들어, +, + 또는 -,-)가 일치하여, 샘플의 최종 결과(양성 또는 음성)를 결정하였다.
지난 10년 동안 많은 연구 그룹은 다중 자가항체 분석을 하나의 웰로 결합하여 대규모 집단을 선별하는 멀티플렉스 방법을 활용하는 고처리량 분석을 찾고 있습니다. 다중 자가항체 분석 19,20,21,22를 수행하기 위해 다양한 유형의 기술을 사용하는 몇 가지 연구가 있지만 T1D를 연구할 때 현재 '금' 표준 RBA에 대한 민감도 및 특이도에서 이러한 분석에 대한 비교는 없습니다. 사용되는 이러한 다양한 유형의 플랫폼은 국제 췌도 자가항체 표준화 프로그램(IASP) 워크숍이나 임상 시험에서 대규모 코호트 테스트를 통해 검증되지 않았습니다. 최근 독일의 일반 인구 기반 스크리닝에서, 크로노스에 의해 배포된 고처리량 결합 분석인 3 스크린 ICATM ELISA는 소아 T1D 23의 조기 진단을 달성하기 위해 3개의 IAb, GADA,IA-2A 및 ZnT8A를 검출하기 위한 1차 스크리닝을 위한 도구로 사용되고 있다. 3-스크린 ELISA 분석은 3개의 분리된 웰에서 많은 양의 혈청을 소비하거나 3개의 분석이 모두 혼합된 단일 웰에서 3개의 자가항체를 측정합니다. 3-스크린 ELISA 분석에서 하나의 웰이 양성이면 3개의 자가항체 중 어느 것이 존재하는지 구별할 수 없습니다. 이 분석의 가장 큰 단점은 IAA 측정을 포함 할 수 없다는 것입니다. IASP 워크샵에서 입증 된 바와 같이 ELISA에 의해 수행 된 모든 IAA 결과는 허용 가능한 민감도 및 특이성을 갖지 않습니다24. IAA는 일반적으로 가장 먼저 나타나는 IAb이며 어린 아이들 사이에서 유병률이 높습니다. IAA와 함께 IAb 스크리닝은 어린이에게 필요하며 지역 사회에서 T1D 위험을 평가하기 위해 IAA 없이 이 스크리닝을 수행하는 것은 허용되지 않는 것으로 간주됩니다. 또한 Kronus IAb 키트 분석이 T1D 질환 특이적이고 고위험과 저위험 IAb를 구별할 수 있음을 보여주는 발표된 연구 또는 데이터는 없습니다. 본 연구에서 7-Plex ECL 분석은 T1D13으로 새로 진단된 환자의 대규모 코호트를 사용하여 검증되었습니다. 현재 표준 RBA 및 잘 확립된 단일 ECL 분석과 비교하여 7-Plex 분석은 동일한 분석 특이성으로 100% 양성을 유지할 수 있습니다(표 4). 현재 표준 RBA와 병행하여 4-Plex ECL 분석은 진행중인 대규모 임상 시험 인 어린이의자가 면역 스크리닝 (ASK) 연구에 적용되고 있습니다. 이 시험은 덴버 대도시 지역의 일반 인구의 어린이를 대상으로 T1D 및 체강 질병을 검사합니다. ASK 연구에 사용된 표준 RBA와 비교하여, 멀티플렉스 ECL 분석은 단일 ECL 연구25를 사용한 이전 보고서와 동일한 우수한 민감도 및 더 높은 질병 특이도를 보여주고 있다. 또한, 당사의 4-Plex ECL 분석은 ECL 및 RBA에 대한 해당 4개의 단일 분석에 비해 노동, 비용 및 혈청 부피가 70% 현저하게 감소한 것으로 나타났습니다. 멀티플렉스 ECL 분석을 사용하여 서로 다른 자가항체(최대 10개)를 나타내는 서로 다른 숫자로 각 웰을 맞춤화하여 특정 임상 위치의 요구에 특정한 다양한 자가면역 질환을 테스트할 수 있습니다.
본 연구에서 멀티플렉스 플레이트를 사용하는 멀티플렉스된 ECL 분석에 대해 관찰된 몇 가지 한계가 있다. 항원과 함께 배양된 혈청의 최종 희석은 단일 웰에 결합된 모든 단일 자가항체 분석에 대해 가장 최적의 조건을 산출하도록 조정할 수 없습니다. T1D 환자로부터의 9개의 샘플(9/1026)은 특정 자가항체에 대해 위음성 결과를 갖는 것으로 관찰되었다. 위음성 중 7 개는 TPOA에 대한 것이고 2 개는 7-Plex ECL 분석에서 ThGA에 대한 것이었지만 단일 ECL 분석과 RBA 모두에서 높은 양성 결과가 나타났습니다 (그림 2 및 3). 9 개의 샘플 모두를 추가로 희석 한 후, 그들은 멀티 플렉스 플레이트에서 양성이되었습니다. 이 결과는 우리가 'prozone'현상으로 설명하는 것에 의해 발생합니다. 이 현상으로 인해 높은 항체가가 항원-항체 격자의 형성에 영향을 미치기 때문에 샘플이 위음성 결과를 나타냅니다. 다중 분석을 설정할 때 결합된 자가항체 각각에 대해 매우 높은 역가를 가진 샘플은 항원 배양을 위한 혈청의 선택적 희석을 식별하기 위해 사전 테스트를 실행하는 것이 좋습니다. 별법으로, 각각의 자가항체에 대해 최상의 분석 감도 및 특이성이 달성되는 조합 분석을 형성하기 위해 유사한 최적화된 조건을 갖는 자가항체 분석을 선택해야 한다. 본 연구에서, 건강한 정상 대조군으로부터의 7 개의 샘플 (7/1022)은 7-Plex 분석에서 여러자가 항체에 대해 위양성을 나타 냈지만, 단일 ECL 분석과 RBA (그림 2 및 3)를 실행 한 후,자가 항체는 두 분석 모두에서 음성으로 밝혀졌다. 이러한 작은 샘플 하위 집합에 대해 멀티플렉스 플레이트에서 발생하는 이러한 위양성 결과의 원인은 현재 알려져 있지 않습니다. 멀티플렉스 ECL 분석의 현재 적용의 경우, 모든 양성 샘플은 양성을 확인하기 위해 해당 단일 ECL 분석으로 반복되며, 이는 멀티플렉스 ECL 분석에서 이 위양성 오류를 제거합니다.

제 1 형 당뇨병 (T1D)은 어린 시절에 가장 흔한 심각한 만성 질환입니다. 현재 미국에서는 약 140 만 명이 T1D를 가지고 있습니다. 놀랍게도 T1D의 발병률은 전 세계적으로 매년 3-5 %로 꾸준히 증가하고 있으며 지난 20 년 동안, 특히 어린 아이들 1,2에서 두 배로 증가했습니다. 혈액 순환에서 췌도 자가항체(IAbs)는 현재 가장 신뢰할 수 있는 바이오마커입니다. IAbs는 임상 T1D가 발생하기 몇 년 전에 나타날 수 있습니다3. 현재 인슐린에 대한자가 항체 (IAA), 글루타메이트 데 카르 복실 라제 -65 (GADA), 인슐린 종 항원 -2 (IA-2A) 및 아연 수송 체 -8 (ZnT8A)을 포함하여 4 가지 주요 IAb가 T1D 진단 및 위험 스크리닝에 널리 사용됩니다. 이 네 가지 IAb는 T1D 개발을 예측하는 데 똑같이 중요합니다. T1D의 분류는 질병 단계 1 4로서 정상적인 포도당 대사를 갖는 임의의4 IAbs 중 ≥2의 존재로서 최근에 재정의되었다.
Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY)에서 T1D에 걸릴 위험이있는 어린이 4 명 중 1 명은 섬, 체강, 갑상선 또는 류마티스자가 면역으로 진행될 가능성이 있으며 더 놀랍게도 T1D 진단을받은 환자의 약 40 %가 결국 추가자가 면역 질환을 앓게됩니다 5,6,7 . 자가항체의 동정은 이러한 자가면역 질환의 예측 및 진단에 필수적이며 환자에게 더 나은 임상 치료를 제공해야 합니다. 현재 이러한 다중자가 면역 질환을 선별하는 쉽고 저렴한 방법은 없습니다. 단일 자가항체 측정으로 표준 방사선 결합 분석(RBA)을 사용하는 현재의 스크리닝 방법은 대규모 스크리닝에 힘들고 비효율적입니다.
여기에서는 단일 ECL 분석 플랫폼 8,9,10,11을 사용하여 인증한 새로 개발된 단순 멀티플렉스 ECL 분석에 대해 설명합니다. 멀티플렉스 ECL 분석은 15μL의 혈청만 사용하여 7개의 자가항체 검사를 단일 웰로 결합하고 체강 질병, 자가면역 갑상선 질환 및 APS-1을 포함한 T1D 및 여러 관련 자가면역 질환을 동시에 스크리닝할 수 있습니다. ZnT8A ECL 분석은 당시 개발되지 않았으며 다중 분석에 포함되지 않았습니다. 멀티플렉스 ECL 분석은 T1D 및 다발성 자가면역 질환에 대한 일반 인구 스크리닝에서 높은 처리량을 위한 탁월한 도구를 제공합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8211;80 &#176;C and -20 &#176;C freezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>Wallac - Delfi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GAD65 full length protein</td>
			<td>Diamyd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ThG full length protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO full length protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 intracellular domain protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#945; protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>DiaRect</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 mL , Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A or B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled deionized (DD) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice maker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Sector</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tower</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette-Aid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes/tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ru Sulfo-NHS</td>
			<td>MSD (R91AN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uplex Development Kit</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well UPlex plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linker-Streptavidin</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R92TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>89892</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases

췌도 자가항체(IAbs)는 제1형 당뇨병(T1D) 진단 및 예측에 널리 사용됩니다. 인슐린 (IAA), 글루타메이트 디카 르 복실 라제 -65 (GADA), 인슐린 종 항원 -2 (IA-2A) 및 아연 수송 체 -8 (ZnT8A)에 대한 4 가지 주요 IAb는 질병 예측에서 똑같이 중요합니다. 현재 T1D 진단을받은 환자의 최대 40 %가 다른자가 면역 질환을 앓고 있습니다. 불행하게도, 측정을 위해 단일 자가항체를 사용하는 현재의 스크리닝 방법은 대규모 스크리닝 연구에 힘들고 비효율적입니다. 우리는 최근 이러한 현재 문제를 해결하기 위해 간단한 다중 전기 화학 발광 (ECL) 분석을 개발했습니다. 이 분석은 7개의 자가항체 검사를 모두 하나의 웰로 결합합니다. 각 웰에는 3개의 IAb(IAA, GADA 및 IA-2A), 자가면역 갑상선 질환을 검출하기 위한 갑상선 과산화효소(TPOA) 및 갑상선 글로불린(ThGA)에 대한 자가항체, 체강 질병에 대한 조직 트랜스글루타미나제(TGA)에 대한 자가항체, 자가면역 다선 증후군-1(APS-1)에 대한 인터페론 알파(IFNαA)에 대한 자가항체가 포함됩니다. 이 모든 것이 T1D 및 기타 관련 자가면역 질환을 동시에 선별합니다. 멀티플렉스 ECL 분석은 단일 ECL 분석 플랫폼을 기반으로 하지만 대신 최대 10개의 여러 자가항체 분석을 단일 웰에 결합하는 멀티플렉스 플레이트를 사용합니다. 단일 ECL 분석과의 주요 차이점은 유체상에서 형성된 각 항체-항원 복합체가 멀티플렉스 플레이트의 링커 시스템을 통해 각 웰의 특정 지점으로 제한된다는 것입니다. 본 연구에서 7-Plex ECL 분석은 새로 진단된 T1D 환자와 연령이 일치하는 건강한 대조군의 대규모 코호트를 사용하여 표준 방사성 결합 분석(RBA) 및 단일 ECL 분석에 대해 검증되어 우수한 분석 민감도와 특이도를 제공합니다.

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A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

7개의 자가항체 분석을 함께 결합하는 간단한 멀티플렉스 ECL 분석을 모델링합니다. 이 분석은 체강 질병,자가 면역 갑상선 질환 및자가 면역 다선 증후군 1을 포함하여 T1D 및 여러 다른자가 면역 질환을 동시에 스크리닝 할 수 있습니다.

고처리량 전기화학발광 7-Plex 분석으로 제1형 당뇨병 및 다발성 자가면역질환 동시 스크리닝

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate ...

a-high-throughput-electrochemiluminescence-7-plex-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

2.4K 조회수.  University of Colorado School of Medicine. 7개의 자가항체 분석을 함께 결합하는 간단한 멀티플렉스 ECL 분석을 모델링합니다. 이 분석은 체강 질병,자가 면역 갑상선 질환 및자가 면역 다선 증후군 1을 포함하여 T1D 및 여러 다른자가 면역 질환을 동시에 스크리닝 할 수 있습니다.

비디오: A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

원격 높은 처리량 Phenotyping에 마우스 눈 핵의 제거

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

연구

의학

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long. 
	There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
	High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS. 
	HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility. 
	Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21. 
	Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

We describe a methodology combining automated cell culturing with high-content imaging to visualize and quantify multiple cellular processes and structures, in a high-throughput manner. Such methods can aid in the further functional annotation of genomes as well as identify disease gene networks and potential drug targets.

Neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Cholesterol Efflux Assay

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of cellular membranes, apoptosis and necrosis 1. Cells can source cholesterol from intracellular synthesis and from plasma lipoproteins, both sources are sufficient to fully satisfy cells' requirements for cholesterol. The processes of cholesterol synthesis and uptake are tightly regulated and deficiencies of cholesterol are rare 2. Excessive cholesterol is more common problem 3. With the exception of hepatocytes and to some degree adrenocortical cells, cells are unable to degrade cholesterol. Cells have two options to reduce their cholesterol content: to convert cholesterol into cholesteryl esters, an option with limited capacity as overloading cells with cholesteryl esters is also toxic, and cholesterol efflux, an option with potentially unlimited capacity. Cholesterol efflux is a specific process that is regulated by a number of intracellular transporters, such as ATP binding cassette transporter proteins A1 (ABCA1) and G1 (ABCG1) and scavenger receptor type B1. The natural acceptor of cholesterol in plasma is high density lipoprotein (HDL) and apolipoprotein A-I. 
The cholesterol efflux assay is designed to quantitate the rate of cholesterol efflux from cultured cells. It measures the capacity of cells to maintain cholesterol efflux and/or the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol released from cells. The assay consists of the following steps. Step 1: labelling cellular cholesterol by adding labelled cholesterol to serum-containing medium and incubating with cells for 24-48 h. This step may be combined with loading of cells with cholesterol. Step 2: incubation of cells in serum-free medium to equilibrate labelled cholesterol among all intracellular cholesterol pools. This stage may be combined with activation of cellular cholesterol transporters. Step 3: incubation of cells with extracellular acceptor and quantitation of movement of labelled cholesterol from cells to the acceptor. If cholesterol precursors were used to label newly synthesized cholesterol, a fourth step, purification of cholesterol, may be required.
The assay delivers the following information: (i) how a particular treatment (a mutation, a knock-down, an overexpression or a treatment) affects the capacity of cell to efflux cholesterol and (ii) how the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol is affected by a disease or a treatment. This method is often used in context of cardiovascular research, metabolic and neurodegenerative disorders, infectious and reproductive diseases.

The cholesterol assay is designed to quantitate the rate of cholesterol efflux from cultured cells and the capacity of plasma acceptors to accept cholesterol released from cells. The assay consists of labelling cells with cholesterol, equilibration of cholesterol among intracellular pools and release of cholesterol to an extracellular acceptor.

콜레스테롤 유출 분석

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

수정 된 침전 법은 요도 엑소 좀을 분리

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

신경 보호 전략에 대한 치료 요인의 납품을위한 설계 성인 줄기 세포의 높은 처리량 특성

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

차 다발성 골수종 세포의 약물 민감도의 특성에 대한의 Organotypic 높은 처리량 시스템

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes an artificial small guide RNA (sgRNA) to guide tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease, tRNase ZL, to recognize a target RNA. sgRNAs can be taken up by cells without any transfection reagents and can downregulate their target RNA levels and/or induce apoptosis in human cancer cells. We have screened an sgRNA library containing 156 heptamer-type sgRNAs for the effect on viability of human myeloma and leukemia cells, and found that 20 of them can efficiently induce apoptosis in at least one of the cancer cell lines. Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers. The protocol includes how to construct the sgRNA library, how to assess the effect of each sgRNA on cell viability, and how to further evaluate the effective sgRNAs by flow cytometry. Around 2,000 hits would be expected to be obtained by screening the full-scale sgRNA library composed of 16,384 heptamers.

Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers.

TRUE 유전자 음소거 : 잠재적 인 암 치료제에 대한 헵 타머 형 소형 가이드 RNA 라이브러리의 심사

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

높은 처리량, 멀티 플렉스 및 대상 단백체 CSF 분석은 퇴행성 신경 바이오 마커 및 아포 지단백 E 이소 상태를 정량화하기

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay formats are currently in use worldwide so there is a need for an accurate and high-throughput method for measuring RSV NAbs. We describe here an imaging-based micro-neutralization assay that has been tested on RSV subgroup A and can also be adapted for RSV subgroup B and different sample types. This method is highly reproducible, with inter-assay variations for the reference antiserum being less than 10%. We believe this assay can be readily established in many laboratories worldwide at relatively low cost. Development of an improved, high-throughput assay that measures RSV NAbs represents a significant step forward for the standardization of this method internationally as well as being critical for the evaluation of novel RSV vaccine candidates in the future.

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

This study describes a high throughput, imaging-based micro-neutralization assay to determine the titer of neutralizing antibodies specific for respiratory syncytial virus (RSV). This assay format has been tested on different sample types.

향상 된 높은 처리량 호흡 Syncytial 바이러스 (RSV) 마이크로 중화 분석 결과

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...