Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH DK32083, JDRF Grants 2-SRA-2015-51-Q-R e 2-SRA-2018-533-S-B.

Il protocollo di ricerca è stato approvato dal Colorado Multiple Institutional Review Board.
1. Preparazione del buffer
<ol><li>Fare il tampone di etichettatura (2x PBS, pH 7,9). Utilizzando 400 ml di acqua distillata deionizzata (DD), aggiungere 100 ml di 10x PBS. Per regolare il pH della soluzione, aggiungere NaOH fino a raggiungere 7,9.</li>
	<li>Creare 3 mM di biotina sciogliendo 1 mg di biotina in 588 μL di tampone di etichettatura precedentemente creato. Produrre 3 mM Ru Sulfo-NHS sciogliendo 150 nmol di Ru Sulfo-NHS in 50 μL di tampone di etichettatura.</li>
	<li>Fare il tampone antigene (1% BSA) prendendo 500 ml di 1x PBS e aggiungendo 5 g di albumina sierica bovina (BSA) alla soluzione. Preparare 0,5 M di soluzione di acido acetico. Preparare il tampone Tris-HCl 1 M utilizzando Trizma Base e regolando il pH a 9,0.</li>
	<li>Per il tampone di rivestimento (3% Blocker A), prelevare 500 mL di 1x PBS e aggiungere 15 g di Blocker A. Preparare il tampone di lavaggio (0,05 % Tween 20, PBST) mescolando 5000 mL di 1x PBS con 2,5 mL di Tween 20. Creare un buffer di lettura (2x Read Buffer T con tensioattivo) aggiungendo 500 mL di acqua DD e 500 mL di 4x Read Buffer T con tensioattivo. NOTA: Per mantenere la coerenza tra i saggi è importante che entrambe le soluzioni di biotina e Ru Sulfo-NHS siano create appena prima della procedura di etichettatura e non vengano create e conservate per un uso futuro.</li>
</ol>2. Etichettatura di ogni proteina dell'antigene con biotina e Ru Sulfo-NHS separatamente
NOTA: Per avere una reazione di marcatura più efficace, utilizzare una concentrazione di proteina dell'antigene di ≥0,5 mg / ml.
<ol><li>Calcolare il numero molare di ciascuna proteina dell'antigene e il numero molare della biotina e del Ru Sulfo-NHS. Aggiungere una quantità adeguata di biotina o Ru Sulfo-NHS alla proteina dell'antigene per la reazione di etichettatura in base al rapporto molare della proteina dell'antigene alla biotina o Ru Sulfo-NHS.<ol><li>Per l'antigene che ha il peso molecolare più piccolo (≤10 kDa), come la proteina proinsulina, utilizzare un rapporto molare di 1:5 (antigene: biotina e Ru Sulfo-NHS). Per l'antigene che ha il peso molecolare maggiore (>50 kDa), come la proteina GAD, utilizzare un rapporto molare di 1:20. Per l'antigene che ha un peso molecolare medio (10-50 kDa), utilizzare un rapporto molare regolato tra 1:5-1:20.</li>
	</ol></li>
	<li>Sia per la biotina che per il Ru Sulfo-NHS, dividere ogni peso dell'antigene per i rispettivi pesi molecolari per ottenere il numero molare dell'antigene per ciascuno. Dividere il numero molare per la concentrazione per ottenere il volume per la biotina. Ripeti questo per Ru Sulfo-NHS.</li>
	<li>Mescolare la proteina dell'antigene con la biotina usando il rapporto molare corretto, determinato al punto 2.2. Quindi fai lo stesso per Ru Sulfo-NHS. NOTA: Per l'efficienza della reazione di etichettatura, qualsiasi sostanza chimica riducente come Tris o glicina nel sistema tampone deve essere sostituita con 2x tampone PBS, pH 7,9 dalla colonna di spin di dimensionamento. I protocolli di etichettatura per biotina e Ru Sulfo-NHS sono identici.</li>
	<li>Coprire i tubi di reazione con un foglio di alluminio e incubarli a temperatura ambiente (RT) per 1 ora. Il motivo per cui copre i tubi di reazione con un foglio è perché sia la biotina che i reagenti Ru Sulfo-NHS sono sensibili alla luce.</li>
	<li>Innescare la colonna di spin da 2 mL o 5 mL mentre i tubi di reazione sono in incubazione (la dimensione della colonna di spin è determinata dal volume caricato sulla colonna). Riempire la colonna di rotazione con 2x tampone PBS e quindi centrifugarla a 1.000 x g per 2 minuti ogni volta, per un totale di tre volte.</li>
	<li>Interrompere la reazione di etichettatura dopo che i tubi di reazione hanno terminato l'incubazione. Per fermare la reazione, purificare la proteina dell'antigene marcata facendola passare attraverso la colonna di spin una volta. Quindi centrifugare la colonna a 1.000 x g per 2 minuti.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione totale di antigene marcato dividendo la quantità di proteina dell'antigene presente per il volume finale. Aliquot 50 μL della proteina dell'antigene marcata purificata per provetta e conservare le aliquote a -80 °C per un uso a lungo termine. NOTA: È importante essere consapevoli del fatto che per ogni volta che la colonna di spin passa attraverso la proteina dell'antigene, ci sarà un tasso di ritenzione del 90-95%.</li>
</ol>3. Definire la migliore concentrazione e i rapporti per i due antigeni marcati per il test (test a scacchiera)
NOTA: Poiché il test ECL-IAA in questo test 7-Plex richiede un trattamento acido dei campioni di siero, il test a scacchiera per ciascun antigene deve passare attraverso questa fase prima di incubare con la miscela di antigene marcata.
<ol><li>Applicare il test a scacchiera per ciascun antigene separatamente prima di eseguire il test multiplex. I passaggi 3.2-3.6 utilizzeranno GAD65 come esempio.</li>
	<li>Calcolare la diluizione della proteina GAD65 marcata. La concentrazione mirata raccomandata della prima soluzione di miscela di GAD65 biotinilato è 2000 ng / mL e Ru Sulfo-NHS marcato GAD65 è 1000 ng / mL. Se la concentrazione di GAD65 biotinilato e Ru Sulfo-NHS marcato GAD65 in soluzione madre è 1,0 μg/μL, il volume necessario per GAD65 biotinilato in 560 μL di soluzione di lavoro sarà 1,12 μL e il volume necessario per Ru Sulfo-NHS marcato GAD65 in 700 μL di soluzione di lavoro sarà 0,7 μL.</li>
	<li>Mescolare 1,12 μL di proteina GAD65 biotinilata con 240 μL di linker 1 coniugato con streptavidina in una provetta e 160 μL di BSA all'1%. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min. Aggiungere 160 μL di soluzione di arresto al tubo e incubare la miscela a temperatura ambiente per altri 30 minuti.</li>
	<li>Fare una diluizione seriale. Prelevare 280 μL della miscela in un nuovo tubo e aggiungere 280 μL di soluzione di arresto per ottenere una diluizione 1:2. Preparare diversi nuovi tubi. Ripetere questo passaggio per eseguire una diluizione seriale orizzontale per l'antigene GAD65 marcato con biotina (fare riferimento alla precedente pubblicazione12).</li>
	<li>Mescolare 0,7 μL di proteina GAD65 (1 μg/μL) marcata con Ru Sulfo-NHS con 700 μL di soluzione di stop. Quindi prendere 350 μL della miscela in un nuovo tubo e aggiungere 350 μL di soluzione di arresto per fare una diluizione 1:2. Preparare diversi nuovi provette, ripetere questo passaggio per eseguire una diluizione seriale verticale per l'antigene GAD65 marcato Ru Sulfo-NHS.</li>
	<li>Preparare due campioni di siero, un campione altamente positivo per GADA e un campione negativo per GADA, ciascuno con un volume di 0,75 ml. Aliquot 15 μL di siero positivo in ogni pozzetto sulla metà sinistra della piastra PCR a 96 pozzetti. Aliquot 15 μL di siero negativo in ogni pozzetto sulla metà destra della piastra PCR a 96 pozzetti.</li>
	<li>Aggiungere 18 μL di acido acetico 0,5 M in ciascun pozzetto e mescolare. Incubare per 45 minuti a RT. Preparare una nuova piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 17,5 μL dell'antigene marcato con biotina e 17,5 μL dell'antigene marcato con Ru Sulfo-NHS in ciascun pozzetto secondo le diluizioni seriali (fare riferimento alla precedente pubblicazione12).</li>
	<li>Continuare le altre fasi del test descritte nei passaggi da 5.2 a 9.1.</li>
	<li>Determinare il rapporto di segnale tra i campioni positivi elevati rispetto ai corrispondenti segnali del campione negativo. Selezionare la migliore concentrazione per l'antigene marcato con biotina e l'antigene marcato Ru Sulfo-NHS identificando il punto che ha il rapporto più alto o vicino al più alto di segnale positivo e negativo. In questo calcolo del rapporto, si consideri il segnale di fondo basso ottenuto dai campioni negativi. NOTA: Le concentrazioni ottimali di Ru Sulfo-NHS e proteine antigene marcate con biotina dai saggi a scacchiera sono mostrate di seguito: 30 ng / mL e 200 ng / mL per GAD65, 120 ng / mL e 120 ng / mL per proinsulina, 10 ng / mL e 42 ng / mL per IA-2, 80 ng / mL e 80 ng / mL per TG, 8 ng / mL e 16 ng / mL per TPO, 31 ng/mL e 31 ng/mL per ThG, e 12 ng/mL e 12 ng/mL per IFNα.</li>
</ol>4. Creare la soluzione di antigene accoppiato a linker misto
<ol><li>Selezionare la concentrazione ottimale per ciascun antigene in base al test a scacchiera. Diluire l'antigene marcato con biotina e Ru Sulfo-NHS alla concentrazione di lavoro razionale.</li>
	<li>Legare diversi linker a ciascuna delle proteine dell'antigene unicamente biotinilate. Per un test su piastra a 96 pozzetti, mescolare 4 μL di GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsulina, proteina IFN-α e IA-2 con 240 μL di linker 1, 2, 3, 4, 8, 9 e 10 coniugati con streptavidina in una provetta separata (Figura 1). Quindi aggiungere 156 μL di PBS/1% BSA per provetta. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Aggiungere 160 μL di soluzione di arresto in ogni tubo e incubarli a temperatura ambiente per altri 30 minuti. Prelevare 400 μL di antigene accoppiato al linker da ciascuna provetta e combinare tutti e 7 gli antigeni insieme. Aggiungere 1,2 mL di soluzione di arresto e quindi aggiungere 4 μL di Ru Sulfo-NHS marcato GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsulina, IFN-α e antigene IA-2 alla miscela. Ora la soluzione di antigene è pronta per essere utilizzata nel test.</li>
</ol>5. Incubare campioni di siero con l'antigene marcato
NOTA: Poiché il test ECL-IAA in questo test 7-Plex richiede il trattamento acido dei campioni di siero, ogni siero richiede la fase di trattamento acido prima di incubare con miscela di antigene marcata per questo test 7-Plex.
<ol><li>Aliquot 15 μL di siero per pozzetto per una piastra PCR a 96 pozzetti. Aggiungere 18 μL di acido acetico 0,5 M in ciascun pozzetto e mescolare. Incubare per 45 minuti a RT. Preparare una nuova piastra PCR a 96 pozzetti e aliquote 35 μL di soluzione di antigene in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Mentre la piastra è ancora in incubazione, aggiungere 13 μL di tampone 1 M Tris pH 9,0 a ciascun pozzetto nella piastra dell'antigene. Aggiungere tampone sul lato di ciascun pozzetto per limitare la miscelazione di tampone Tris e antigene. Al termine dell'incubazione, prelevare 25 μL del siero trattato con acido e pipettarlo immediatamente in ogni pozzetto sulla piastra dell'antigene. Agitare la soluzione e coprire la piastra con un foglio sigillante PCR per evitare l'esposizione alla luce.</li>
	<li>A RT, mettere la piastra su uno shaker, impostato a bassa velocità, per 1 ora. Successivamente, conservare la piastra a 4 °C e lasciarla incubare per 18-24 ore.</li>
</ol>6. Preparare la piastra multiplex
<ol><li>Prelevare una piastra multiplex dal frigorifero a 4 °C e lasciare che la piastra arrivi a RT. Una volta che la piastra multiplex è a RT, aggiungere 150 μL di 3% Blocker A a ciascun pozzetto. Coprire la piastra multiplex con un foglio sigillante. Incubare la piastra in frigorifero a 4 °C durante la notte. NOTA: il giorno 1 del test include i passaggi da 4 a 6.</li>
</ol>7. Trasferire siero/antigene incubati nella piastra multiplex
<ol><li>Il giorno seguente, metti i tovaglioli di carta sul tavolo e prendi la piastra multiplex di incubazione dal frigorifero. Svuotare tutto il buffer dalla piastra. Per fare questo, capovolgere il piatto e picchiettarlo sui tovaglioli di carta preparati fino a quando non è presente alcun tampone in nessuno dei pozzetti.</li>
	<li>Lavare la piastra multiplex aggiungendo 150 μL di PBST in ogni pozzetto. Eliminare il buffer, come indicato nel passaggio 7.1., e ripetere questo passaggio tre volte. Aggiungere 30 μL di siero/antigene incubato in ogni pozzetto nella piastra multiplex. Coprire la piastra con un foglio per limitare l'esposizione alla luce. Posizionare la piastra su uno scuotipia, impostato a bassa velocità, a RT per 1 ora.</li>
</ol>8. Lavare la piastra e aggiungere il buffer di lettura
<ol><li>Rimuovere il siero/antigene incubato dalla piastra multiplex tenendo la piastra capovolta e facendo scorrere la soluzione. Aggiungere 150 μL di PBST in tutti i pozzetti e rimuovere il tampone dalla piastra tenendo nuovamente la piastra capovolta e facendo uscire la soluzione. Ripetere questo passaggio tre volte. Al termine del terzo lavaggio, aggiungere 150 μL di tampone di lettura in ciascun pozzetto. NOTA: le bolle d'aria interferiscono con la capacità della macchina per il lettore di lastre di analizzare accuratamente i risultati della piastra e dovrebbero essere evitate a tutti i costi.</li>
</ol>9. Leggere la targa e analizzare i dati
<ol><li>Contare la piastra preparata sulla macchina del lettore di piastre, leggendo tutti i valori in conteggi al secondo (CPS).</li>
	<li>Calcolare l'indice relativo per il saggio, utilizzando i livelli di anticorpi ottenuti dalla macchina lettore di piastre, con la seguente equazione: Valore indice = [CPS (campione) - CPS (standard negativo)] / [CPS (standard positivo) - CPS (standard negativo)].</li>
	<li>Determinare quali risultati anticorpali sono negativi o positivi utilizzando i cut-off che sono stati stabiliti. NOTA: il giorno 2 del test include i passaggi da 7 a 9.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+trends+in+the+incidence+of+type+1+diabetes+in+Finnish+children:+a+cohort+study.">Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study.</a> Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).</li><li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth.">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+Screen+ELISA+for+High-Throughput+Detection+of+Beta+Cell+Autoantibodies+in+Capillary+Blood.">3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li><li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Antibody+Standardization+Program:+evaluation+of+assays+for+insulin+autoantibodies.">Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies.</a> Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+combining+insulin,+GAD,+IA-2+and+transglutaminase+autoantibodies+to+facilitate+screening+for+pre-type+1+diabetes+and+celiac+disease.">A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In numerosi studi clinici nazionali e internazionali per il diabete di tipo 1, le prestazioni del singolo saggio ECL per rilevare gli autoanticorpi delle isole e gli autoanticorpi alla transglutaminasi (TGA) per la celiachia, sono state confermate 8,9,10,11. Nel corso di queste tracce, questo test ha aumentato la sensibilità e la specificità per il rilevamento dell'autoantigene quando valutato rispetto all'attuale RBA "gold" standard. La maggiore specificità della malattia può essere vista quando si discriminano gli autoanticorpi delle isole ad alta affinità e ad alto rischio da segnali a basso rischio e bassa affinità, tra il singolo test ECL e la RBA14,15,16,17. Sulla base del singolo test ECL, presentiamo un nuovo test di autoanticorpi ECL multiplex ad alto rendimento, per consentirci di eseguire lo screening del T1D e di diverse malattie autoimmuni applicabili allo stesso tempo.
Il test ECL multiplex utilizza la piastra multiplex, che può combinare fino a 10 saggi di autoanticorpi in un unico pozzetto. Per il presente studio, 7 saggi di autoanticorpi sono combinati insieme. Gli autoanticorpi comprendono 3 IAb (IAA, GADA e IA-2A), 2 autoanticorpi per la malattia autoimmune della tiroide (TPOA e ThGA), autoanticorpi per la celiachia (TGA) e autoanticorpi APS-1 contro l'interferone alfa (IFNαA). Il meccanismo di analisi è, in generale, basato su un singolo test ECL come precedentemente pubblicato 9,10,12,18 con alcune modifiche. La principale differenza di un test ECL multiplex da un singolo test ECL è che ogni complesso anticorpo-antigene formato nella fase fluida è vincolato a un linker specifico (Figura 1). L'antigene marcato con biotina viene incubato con la streptavidina coniugata, un linker utilizzato per formare uno specifico complesso antigene-linker. Il complesso immunitario anticorpo-antigene si forma dopo l'incubazione con il siero del paziente e viene catturato in un punto specifico attraverso il sistema di linker specifico su ciascun pozzetto della piastra multiplex. L'antigene marcato Ru Sulfo-NHS catturato dagli anticorpi allo stesso tempo fornisce il segnale con elettrochemiluminescenza. La macchina lettore di piastre può rilevare fino a 10 segnali diversi dalle sorgenti spot situate in ciascun pozzetto. Per mantenere i test degli autoanticorpi coerenti tra le piastre e durante la conduzione di studi a lungo termine, suggeriamo di utilizzare lo stesso linker.
Prima di impostare un test ECL multiplex, i singoli saggi ECL per ciascun autoanticorpo devono essere ottimizzati su una piastra multiplex, rispettivamente, e convalidati sia rispetto ai test RBA che a quelli ECL singoli su una piastra ECL regolare. Per migliorare il test a scacchiera, al relativo test di autoanticorpi sulla piastra multiplex, sono stati utilizzati un campione di paziente altamente positivo e un campione di paziente negativo. Dopo che è stato condotto il test a scacchiera, le concentrazioni più ideali per Ru Sulfo-NHS e l'antigene marcato con biotina sono state calcolate per ciascuno dei 7 saggi di autoanticorpi. Quanto segue mostra queste concentrazioni: 30 ng/mL e 200 ng/mL per GAD65, 120 ng/mL e 120 ng/mL per la proinsulina, 10 ng/mL e 42 ng/mL per IA-2, 80 ng/mL e 80 ng/mL per TG, 8 ng/mL e 16 ng/mL per TPO, 31 ng/mL e 31 ng/mL per ThG, e 12 ng/mL e 12 ng/mL rispettivamente per IFNα13. Potrebbe essere necessario regolare ulteriormente le concentrazioni di alcuni degli antigeni del test a scacchiera in base ai risultati del test multiplex effettivo dopo aver combinato tutti i test insieme.
Poiché l'IAA è inclusa nel presente test ECL multiplex, il trattamento acido dei campioni di siero è obbligatorio prima di incubare il siero con l'antigene, come riportato nel precedente studio12. Generalmente, quando un autoanticorpo extra viene aggiunto a un test multiplex, lo sfondo del test è influenzato e un segnale estremamente alto da un punto, nel pozzo, può ostruire i risultati dei punti vicini tramite diafonia. Pertanto, il CPS massimo deve essere limitato a 20.000 conteggi per ciascun autoanticorpo, o inferiore, per i campioni positivi più alti. Dalle nostre conoscenze, al fine di ridurre la quantità di diafonia coinvolta, gli autoanticorpi che hanno uno sfondo inferiore dovrebbero essere separati, quando si progetta la mappa spot, lontano dai punti con una maggiore frequenza di conteggi.
Elevati controlli positivi e negativi sono stati utilizzati internamente in ogni test per calcolare un indice accurato per i campioni sconosciuti sottoposti a test. Per valutare e monitorare accuratamente la sensibilità del test, sono stati utilizzati controlli positivi bassi, impostati vicino al limite superiore del test. Questi controlli standard positivi e negativi sono stati creati in blocco e in aliquote per uso a lungo termine e conservati a -20 °C o meno, per coerenza tra i saggi. Ai fini della garanzia della qualità, i campioni sono stati eseguiti due volte in ogni test e ogni risultato positivo è stato rieseguito e confermato eseguendo il campione in un nuovo test ECL il giorno successivo. In caso di disaccordo con il primo e il secondo test di conferma, era necessario un terzo test. Dei tre test condotti, i risultati dei due test che concordano (ad esempio, +, + o -,-), hanno determinato il risultato finale (positivo o negativo) del campione.
Nell'ultimo decennio, molti gruppi di studio stanno cercando un test ad alto rendimento utilizzando il metodo multiplex per combinare più saggi autoanticorpali insieme in un unico pozzo per lo screening di grandi popolazioni. Ci sono alcuni studi che utilizzano diversi tipi di tecnologie per condurre saggi di autoanticorpi multiplex 19,20,21,22, ma non c'è confronto per nessuno di questi test in sensibilità e specificità rispetto all'attuale RBA "gold" standard, quando si studia T1D. Questi diversi tipi di piattaforme utilizzate non sono convalidate attraverso il workshop internazionale Islet Autoantibody Standardization Program (IASP) o attraverso test di grandi coorti in studi clinici. In un recente screening generale basato sulla popolazione in Germania, un test combinato ad alto rendimento, 3 Screen ICATM ELISA distribuito da Kronus, viene utilizzato come strumento per lo screening di prima linea per rilevare tre IAb, GADA, IA-2A e ZnT8A, per ottenere una diagnosi precoce del T1D23 infantile. Il test ELISA a 3 schermi misura 3 autoanticorpi in 3 pozzetti separati, consumando un grande volume di siero, o in un singolo pozzetto con tutti e 3 i saggi miscelati. Se un pozzetto nel test ELISA a 3 schermi è positivo, non si è in grado di distinguere quale dei tre autoanticorpi è presente. Il più grande svantaggio di questo test è la sua incapacità di includere la misurazione IAA. Tutti i risultati IAA eseguiti da ELISA, come dimostrato nei workshop IASP, non hanno una sensibilità e specificità accettabili24. IAA è di solito il primo IAb a comparire e ha un'alta prevalenza tra i bambini piccoli. Lo screening IAb, con IAA, è necessario per i bambini e non è ritenuto accettabile condurre questo screening senza IAA per valutare il rischio di T1D nella comunità. Inoltre, non ci sono studi o dati pubblicati che dimostrino che il test del kit Kronus IAb sia più specifico per la malattia T1D e in grado di discriminare IAb ad alto rischio da IAb a basso rischio. Il test ECL 7-Plex, nel presente studio, è stato convalidato utilizzando un'ampia coorte di pazienti di nuova diagnosi conT1D 13. Rispetto all'attuale RBA standard e al consolidato test ECL singolo, il test 7-Plex è in grado di mantenere il 100% di positività con la stessa specificità del test (Tabella 4). Attualmente, il test 4-Plex ECL, parallelo allo standard RBA, viene applicato a un ampio studio clinico in corso: lo studio Autoimmunity Screening for Kids (ASK). Questo studio esamina i bambini nella popolazione generale, dell'area metropolitana di Denver, per T1D e celiachia. Rispetto all'RBA standard utilizzato nello studio ASK, il test ECL multiplex sta mostrando un'eccellente sensibilità e una maggiore specificità della malattia, identica ai nostri precedenti rapporti utilizzando il singolo studio ECL25. Inoltre, il nostro test ECL 4-Plex ha dimostrato una marcata riduzione del travaglio, dei costi e del volume sierico del 70%, rispetto ai corrispondenti 4 test singoli per ECL e RBA. Utilizzando il test ECL multiplexato, possiamo personalizzare ogni pozzetto con numeri diversi, che rappresentano diversi autoanticorpi (fino a 10), per testare diverse malattie autoimmuni specifiche per le esigenze di una particolare sede clinica.
Ci sono alcune limitazioni osservate, mostrate nel presente studio, per un test ECL multiplex utilizzando la piastra multiplex. La diluizione finale del siero, incubato con antigene, non può essere regolata per produrre le condizioni ottimali per ogni singolo test di autoanticorpi combinato in un singolo pozzetto. Nove campioni (9/1026), da pazienti T1D, sono stati osservati per avere un risultato falso negativo per particolari autoanticorpi. 7 dei falsi negativi erano per TPOA e 2 erano per ThGA, nel test 7-Plex ECL, ma sono stati esposti risultati positivi sia nel singolo test ECL che nella RBA (Figura 2 e 3). Dopo un'ulteriore diluizione di tutti e 9 i campioni, sono diventati positivi sulla piastra multiplex. Questo risultato è causato da quello che descriviamo come il fenomeno "prozona". Questo fenomeno fa sì che il campione mostri un risultato falso negativo perché gli alti titoli anticorpali stanno influenzando la formazione dei reticoli antigene-anticorpo. Quando si imposta un test multiplex, si raccomanda di eseguire campioni con titoli molto elevati, per ciascuno degli autoanticorpi combinati, per eseguire test preliminari per identificare la diluizione facoltativa del siero per l'incubazione dell'antigene. In alternativa, devono essere selezionati saggi di autoanticorpi con condizioni ottimizzate simili per formare un test combinato da cui si ottiene la migliore sensibilità e specificità del saggio per ciascun autoanticorpo. Nel presente studio, 7 campioni (7/1022), da controlli normali sani, hanno determinato falsi positivi per più autoanticorpi nel test 7-Plex, ma dopo aver eseguito un singolo test ECL e RBA (Figura 2 e 3) questi autoanticorpi sono risultati negativi in entrambi i test. Le ragioni alla base di questi risultati falsi positivi che si verificano sulla piastra multiplex, per questo piccolo sottoinsieme di campioni, sono attualmente sconosciute. Per l'applicazione corrente del test ECL multiplex, tutti i campioni positivi vengono ripetuti con il loro corrispondente test ECL singolo per confermare la positività, che rimuove questo errore falso positivo dal test ECL multiplex.

Il diabete di tipo 1 (T1D) è una grave malattia cronica che è più comune durante l'infanzia. Attualmente, circa 1,4 milioni di persone hanno il T1D negli Stati Uniti; sorprendentemente, l'incidenza del T1D è in costante aumento del 3-5% ogni anno in tutto il mondo ed è raddoppiata negli ultimi due decenni, specialmente nei bambini piccoli 1,2. Gli autoanticorpi delle isole (IAbs) nella circolazione sanguigna sono attualmente il biomarcatore più affidabile. Gli IAbs possono comparire anni prima che il T1D clinico si sviluppi3. Attualmente, quattro principali IAb sono ampiamente utilizzati nella diagnosi di T1D e nello screening del rischio, tra cui gli autoanticorpi contro l'insulina (IAA), la glutammato decarbossilasi-65 (GADA), l'antigene dell'insulinoma-2 (IA-2A) e il trasportatore di zinco-8 (ZnT8A). Questi quattro IAb sono ugualmente importanti nella previsione dello sviluppo di T1D. La classificazione del T1D è stata recentemente ridefinita come la presenza di ≥2 di ogni 4 IAb con un normale metabolismo del glucosio come stadio della malattia 14.
Nel Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY), è stato rivelato che un bambino su quattro a rischio di T1D aveva probabilità di progredire verso l'autoimmunità delle isole, della celiachia, della tiroide o reumatoide e, cosa più sorprendente, circa il 40% dei pazienti a cui è stato diagnosticato il T1D alla fine sviluppa un'ulteriore condizione autoimmune 5,6,7 . L'identificazione degli autoanticorpi è essenziale per la previsione e la diagnosi di queste malattie autoimmuni e dovrebbe fornire una migliore assistenza clinica ai pazienti. Al momento non esiste un modo semplice ed economico per lo screening di queste molteplici condizioni autoimmuni. Gli attuali metodi di screening che utilizzano il saggio standard di radio-legame (RBA), con una singola misurazione degli autoanticorpi, sono laboriosi e inefficienti per uno screening su larga scala.
Qui, descriveremo il test ECL multiplexato semplice di nuova concezione, che abbiamo autenticato utilizzando una singola piattaforma di analisi ECL 8,9,10,11. Il test ECL multiplex combina 7 test autoanticorpali in un unico pozzetto, utilizzando solo 15 μL di siero, ed è in grado di eseguire lo screening per T1D e più malattie autoimmuni rilevanti contemporaneamente tra cui celiachia, malattia autoimmune della tiroide e APS-1. Un test ECL ZnT8A non era stato sviluppato al momento e non è stato incluso nel test multiplexato. Il test ECL multiplex fornisce uno strumento eccellente per l'elevata produttività nello screening della popolazione generale per T1D e malattie autoimmuni multiple.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8211;80 &#176;C and -20 &#176;C freezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>Wallac - Delfi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GAD65 full length protein</td>
			<td>Diamyd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ThG full length protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO full length protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 intracellular domain protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#945; protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>DiaRect</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 mL , Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A or B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled deionized (DD) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice maker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Sector</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tower</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette-Aid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes/tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ru Sulfo-NHS</td>
			<td>MSD (R91AN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uplex Development Kit</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well UPlex plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linker-Streptavidin</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R92TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>89892</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases

Gli autoanticorpi delle isole (IAbs) sono ampiamente utilizzati nella diagnosi e nella previsione del diabete di tipo 1 (T1D). Quattro principali IAb all'insulina (IAA), glutammato decarbossilasi-65 (GADA), insulinoma antigene-2 (IA-2A) e trasportatore di zinco-8 (ZnT8A) sono ugualmente importanti nella previsione della malattia. Attualmente, fino al 40% dei pazienti con diagnosi di T1D continua a sviluppare altri disturbi autoimmuni. Sfortunatamente, gli attuali metodi di screening che utilizzano un singolo autoanticorpo per la misurazione sono laboriosi e inefficienti per studi di screening su larga scala. Recentemente abbiamo sviluppato un semplice test di elettrochemiluminescenza multipla (ECL) per affrontare questi problemi attuali. Il test combina tutti e 7 i test degli autoanticorpi in un unico pozzetto. Ogni pozzetto include tre IAb (IAA, GADA e IA-2A), autoanticorpi contro la perossidasi tiroidea (TPOA) e la globulina tiroidea (ThGA) per rilevare la malattia autoimmune della tiroide, autoanticorpi contro la transglutaminasi tissutale (TGA) per la celiachia e autoanticorpi contro l'interferone alfa (IFNαA) per la sindrome polighiandolare autoimmune-1 (APS-1); tutti i quali schermano il T1D e altre malattie autoimmuni rilevanti, contemporaneamente. Il test ECL multiplex si basa sulla singola piattaforma di analisi ECL, ma utilizza invece la piastra multiplex che combina più saggi autoanticorpali, fino a 10, in un singolo pozzetto. La principale differenza rispetto al singolo test ECL è che ogni complesso anticorpo-antigene formato nella fase fluida viene trattenuto su un punto specifico su ciascun pozzetto attraverso un sistema linker sulla piastra multiplex. Il test ECL 7-Plex, nel presente studio, è convalidato rispetto ai saggi standard di radio-legame (RBA) e ai singoli saggi ECL, utilizzando un'ampia coorte di pazienti T1D di nuova diagnosi e controlli sani di pari età, con conseguente eccellente sensibilità e specificità del test.

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A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Modelliamo un semplice test ECL multiplex che combina 7 saggi di autoanticorpi insieme. Il test è in grado di eseguire lo screening per il T1D e molte altre malattie autoimmuni, contemporaneamente, tra cui la celiachia, la malattia autoimmune della tiroide e la sindrome polighiandolare autoimmune 1.

Un test di elettrochemiluminescenza 7-plex ad alta produttività che esegue simultaneamente lo screening per il diabete di tipo 1 e le malattie autoimmuni multiple

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate ...

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Medicine

2.3K Views.  University of Colorado School of Medicine. Modelliamo un semplice test ECL multiplex che combina 7 saggi di autoanticorpi insieme. Il test è in grado di eseguire lo screening per il T1D e molte altre malattie autoimmuni, contemporaneamente, tra cui la celiachia, la malattia autoimmune della tiroide e la sindrome polighiandolare autoimmune 1.

Video: A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

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Medicina

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long. 
	There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
	High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS. 
	HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility. 
	Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21. 
	Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

We describe a methodology combining automated cell culturing with high-content imaging to visualize and quantify multiple cellular processes and structures, in a high-throughput manner. Such methods can aid in the further functional annotation of genomes as well as identify disease gene networks and potential drug targets.

Contenuto di screening ad alto contenuto di Malattie Neurodegenerative

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Un metodo di precipitazione modificata per isolare urinaria Esosomi

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes an artificial small guide RNA (sgRNA) to guide tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease, tRNase ZL, to recognize a target RNA. sgRNAs can be taken up by cells without any transfection reagents and can downregulate their target RNA levels and/or induce apoptosis in human cancer cells. We have screened an sgRNA library containing 156 heptamer-type sgRNAs for the effect on viability of human myeloma and leukemia cells, and found that 20 of them can efficiently induce apoptosis in at least one of the cancer cell lines. Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers. The protocol includes how to construct the sgRNA library, how to assess the effect of each sgRNA on cell viability, and how to further evaluate the effective sgRNAs by flow cytometry. Around 2,000 hits would be expected to be obtained by screening the full-scale sgRNA library composed of 16,384 heptamers.

Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers.

TRUE silenziamento genico: Proiezione di un Heptamer di tipo piccolo RNA guida Library per potenziali agenti terapeutici cancro

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

A High Throughput, Multiplexer e mirata Proteomica CSF test per quantificare neurodegenerative Biomarkers e apolipoproteina E Isoforme Stato

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Analisi di efflusso di High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay formats are currently in use worldwide so there is a need for an accurate and high-throughput method for measuring RSV NAbs. We describe here an imaging-based micro-neutralization assay that has been tested on RSV subgroup A and can also be adapted for RSV subgroup B and different sample types. This method is highly reproducible, with inter-assay variations for the reference antiserum being less than 10%. We believe this assay can be readily established in many laboratories worldwide at relatively low cost. Development of an improved, high-throughput assay that measures RSV NAbs represents a significant step forward for the standardization of this method internationally as well as being critical for the evaluation of novel RSV vaccine candidates in the future.

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

This study describes a high throughput, imaging-based micro-neutralization assay to determine the titer of neutralizing antibodies specific for respiratory syncytial virus (RSV). This assay format has been tested on different sample types.

Un'analisi di Micro-neutralizzazione del Virus respiratorio sinciziale (RSV) migliorata e ad alta velocità di trasmissione

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Analisi ad alta velocità effettiva dei dati di mappatura ottica tramite ElectroMapHigh-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

Un metodo ad alto throughput in Situ per la stima della ploidia nucleare epatica nei topi

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...