Bu çalışma NIH hibe DK32083, JDRF Hibeleri 2-SRA-2015-51-Q-R ve 2-SRA-2018-533-S-B tarafından desteklenmiştir.

Araştırma protokolü Colorado Çoklu Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı.
1. Tampon hazırlama
<ol><li>Etiketleme tamponunu yapın (2x PBS, pH 7,9). 400 mL damıtılmış deiyonize (DD) su kullanarak, 100 mL 10x PBS ekleyin. Çözeltinin pH'ını ayarlamak için, 7.9'a ulaşana kadar NaOH ekleyin.</li>
	<li>1 mg biyotin'i daha önce oluşturulan 588 μL etiketleme tamponuna çözerek 3 mM biyotin oluşturun. 150 nmol Ru Sulfo-NHS'yi 50 μL etiketleme tamponuna çözerek 3 mM Ru Sulfo-NHS yapın.</li>
	<li>500 mL 1x PBS alarak ve çözeltiye 5 g sığır serum albümini (BSA) ekleyerek antijen tamponunu (% 1 BSA) yapın. 0.5 M asetik asit çözeltisi hazırlayın. Trizma Base kullanarak ve pH'ı 9.0'a ayarlayarak 1 M Tris-HCl tamponu hazırlayın.</li>
	<li>Kaplama tamponu için (%3 Bloker A), 500 mL 1x PBS alın ve 15 g Bloker A ekleyin. 5000 mL 1x PBS'yi 2,5 mL Ara 20 ile karıştırarak yıkama tamponunu (%0,05 Ara 20, PBST) hazırlayın. 500 mL DD su ve 500 mL 4x Yüzey Aktif Maddeli Okuma Arabelleği T ekleyerek okuma tamponu (yüzey aktif madde ile 2x Okuma Arabelleği T) oluşturun. NOT: Tahliller arasındaki tutarlılığı korumak için, hem biyotin hem de Ru Sulfo-NHS çözeltilerinin etiketleme prosedüründen hemen önce oluşturulması ve gelecekte kullanılmak üzere oluşturulmaması ve saklanmaması önemlidir.</li>
</ol>2. Her antijen proteininin biyotin ve Ru Sulfo-NHS ile ayrı ayrı etiketlenmesi
NOT: Daha etkili bir etiketleme reaksiyonuna sahip olmak için, ≥0.5 mg / mL'lik bir antijen protein konsantrasyonu kullanın.
<ol><li>Her antijen proteininin molar sayısını ve biyotin ve Ru Sulfo-NHS'nin molar sayılarını hesaplayın. Antijen proteininin biyotin veya Ru Sulfo-NHS'ye molar oranına göre reaksiyonu etiketlemek için antijen proteinine uygun miktarda biyotin veya Ru Sulfo-NHS ekleyin.<ol><li>Proinsülin proteini gibi daha küçük moleküler ağırlığa (≤10 kDa) sahip antijen için, 1: 5'lik bir molar oran kullanın (antijen: biotin ve Ru Sulfo-NHS). GAD proteini gibi daha büyük moleküler ağırlığa (>50 kDa) sahip antijen için, 1:20'lik bir molar oran kullanın. Orta moleküler ağırlığa (10-50 kDa) sahip antijen için, 1:5-1:20 arasında ayarlanmış bir molar oran kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hem biyotin hem de Ru Sulfo-NHS için, her biri için antijen molar sayısını elde etmek için her antijen ağırlığını karşılık gelen moleküler ağırlıklarına bölün. Biotin hacmini elde etmek için molar sayıyı konsantrasyona bölün. Bunu Ru Sulfo-NHS için tekrarlayın.</li>
	<li>Antijen proteinini, adım 2.2'de belirlenen uygun molar oranı kullanarak biyotin ile karıştırın. O zaman Ru Sulfo-NHS için de aynısını yapın. NOT: Etiketleme reaksiyonunun etkinliği için, tampon sistemindeki Tris veya glisin gibi indirgeyici kimyasalların, boyutlandırma spin sütunu tarafından 2x PBS tamponuna, pH 7.9'a değiştirilmesi gerekir. Biotin ve Ru Sulfo-NHS için etiketleme protokolleri aynıdır.</li>
	<li>Reaksiyon tüplerini alüminyum folyo ile örtün ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. Reaksiyon tüplerinin folyo ile kaplanmasının nedeni, hem biyotin hem de Ru Sulfo-NHS reaktiflerinin ışığa duyarlı olmasıdır.</li>
	<li>Reaksiyon tüpleri inkübe olurken 2 mL veya 5 mL spin kolonunu astarlayın (spin kolonunun boyutu, kolona yüklenen hacimle belirlenir). Döndürme sütununu 2x PBS arabelleğe doldurun ve ardından her seferinde 2 dakika boyunca toplam üç kez 1.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Reaksiyon tüpleri inkübasyonu bitirdikten sonra etiketleme reaksiyonunu durdurun. Reaksiyonu durdurmak için, etiketli antijen proteinini spin kolonundan bir kez geçirerek saflaştırın. Ardından sütunu 2 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj edin.</li>
	<li>Mevcut antijen proteini miktarını nihai hacme bölerek toplam etiketli antijen konsantrasyonunu hesaplayın. Tüp başına saflaştırılmış etiketli antijen proteininin Aliquot 50 μL'si ve uzun süreli kullanım için alikotları -80 ° C'de saklayın. NOT: Spin kolonunun antijen proteinini her geçtiğinde, yaklaşık% 90-95'lik bir retansiyon oranı olacağının farkında olmak önemlidir.</li>
</ol>3. Tahlil için iki etiketli antijen için en iyi konsantrasyonu ve oranları tanımlayın (dama tahtası testi)
NOT: Bu 7-Plex testindeki ECL-IAA testi, serum örneklerinin asit tedavisini gerektirdiğinden, her antijen için dama tahtası testi, etiketli antijen karışımı ile inkübe edilmeden önce bu adımdan geçmelidir.
<ol><li>Multipleks tahlilini çalıştırmadan önce her antijen için dama tahtası testini ayrı ayrı uygulayın. Adım 3.2-3.6'da örnek olarak GAD65 kullanılacaktır.</li>
	<li>Etiketli GAD65 proteininin seyreltilmesini hesaplayın. Biyotinile GAD65'in ilk karışım çözeltisinin önerilen hedeflenen konsantrasyonu 2000 ng / mL'dir ve GAD65 etiketli Ru Sulfo-NHS 1000 ng / mL'dir. Stok çözeltisinde hem biyotinile edilmiş hem de Ru Sulfo-NHS etiketli GAD65'in konsantrasyonu 1.0 μg / μL ise, 560 μL çalışma çözeltisinde biyotinile GAD65 için gereken hacim 1.12 μL olacak ve 700 μL çalışma çözeltisinde GAD65 etiketli Ru Sulfo-NHS için gereken hacim 0.7 μL olacaktır.</li>
	<li>1.12 μL biyotinile GAD65 proteinini, bir tüpte 240 μL streptavidin-konjuge bağlayıcı 1 ve 160 μL% 1 BSA ile karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Tüpe 160 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 30 dakika daha inkübe edin.</li>
	<li>Seri seyreltme yapın. Karışımın 280 μL'sini yeni bir tüpe alın ve 1:2 seyreltme yapmak için 280 μL durdurma çözeltisi ekleyin. Birkaç yeni tüp hazırlayın. GAD65 antijeni etiketli biyotin için yatay seri seyreltme çalıştırmak üzere bu adımı tekrarlayın (önceki yayın12'ye bakın).</li>
	<li>0.7 μL Ru Sulfo-NHS etiketli GAD65 (1 μg / μL) proteinini 700 μL durdurma çözeltisi ile karıştırın. Daha sonra karışımın 350 μL'sini yeni bir tüpe alın ve 1: 2 seyreltme yapmak için 350 μL durdurma çözeltisi ekleyin. Birkaç yeni tüp hazırlayın, GAD65 antijeni etiketli Ru Sulfo-NHS için dikey bir seri seyreltme çalıştırmak için bu adımı tekrarlayın.</li>
	<li>Her biri 0.75 mL'lik bir hacme sahip olan GADA için bir numune yüksek pozitif ve GADA için bir numune negatif olmak üzere iki serum örneği hazırlayın. Aliquot 15 μL pozitif serum, 96 kuyucuklu PCR plakasının sol yarısındaki her bir kuyucuğa. Aliquot 15 μL negatif serum, 96 kuyucuklu PCR plakasının sağ yarısındaki her bir kuyucuğa.</li>
	<li>Her bir kuyucuğa 18 μL 0,5 M asetik asit ekleyin ve karıştırın. RT'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Yeni bir 96 delikli PCR plakası hazırlayın. Seri seyreltmelere göre her bir kuyucuğa biyotin etiketli antijenin 17.5 μL'sini ve Ru Sulfo-NHS etiketli antijenin 17.5 μL'sini ekleyin (önceki yayın12'ye bakınız).</li>
	<li>Adım 5.2 ile 9.1 arasındaki adımlarda açıklanan diğer tahlil adımlarına devam edin.</li>
	<li>Yüksek pozitif numunelerden gelen sinyal oranını, karşılık gelen negatif numune sinyallerine karşı belirleyin. Biotin etiketli antijen ve Ru Sulfo-NHS etiketli antijen için en iyi konsantrasyonu, pozitif-negatif sinyalin en yüksek veya en yüksek oranına yakın olan noktayı tanımlayarak seçin. Bu oran hesaplamasında, negatif numunelerden elde edilen düşük arka plan sinyalini göz önünde bulundurun. NOT: Dama tahtası testlerinden Ru Sulfo-NHS ve biotin etiketli antijen proteinlerinin optimal konsantrasyonları aşağıda gösterilmiştir: GAD65 için 30 ng/mL ve 200 ng/mL, proinsülin için 120 ng/mL ve 120 ng/mL, IA-2 için 10 ng/mL ve 42 ng/mL, TG için 80 ng/mL ve 80 ng/mL, TPO için 8 ng/mL ve 16 ng/mL, ThG için 31 ng/mL ve 31 ng/mL ve IFNα için 12 ng/mL ve 12 ng/mL.</li>
</ol>4. Karışık bağlayıcı bağlantılı antijen çözeltisini oluşturun
<ol><li>Dama tahtası testine dayanarak her antijen için en uygun konsantrasyonu seçin. Biyotin ve Ru Sulfo-NHS etiketli antijeni rasyonel çalışma konsantrasyonuna seyreltin.</li>
	<li>Benzersiz biyotinile antijen proteinlerinin her birine farklı bağlayıcılar bağlayın. Bir 96 kuyucuklu plaka testi için, 4 μL biyotinile GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsülin, IFN-α ve IA-2 proteinini 240 μL streptavidin-konjuge bağlayıcı 1, 2, 3, 4, 8, 9 ve 10 ile ayrı bir tüpe karıştırın (Şekil 1). Daha sonra tüp başına 156 μL PBS / % 1 BSA ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Her tüpe 160 μL durdurma çözeltisi ekleyin ve 30 dakika daha oda sıcaklığında inkübe edin. Her tüpten 400 μL bağlayıcı antijen alın ve 7 antijenin tümünü bir araya getirin. 1.2 mL durdurma çözeltisi ekleyin ve ardından karışıma GAD65, TPO, tTG, ThG, proinsülin, IFN-α ve IA-2 antijeni etiketli 4 μL Ru Sulfo-NHS ekleyin. Şimdi antijen çözeltisi tahlilde kullanılmaya hazır.</li>
</ol>5. Serum örneklerini etiketli antijenle inkübe edin
NOT: Bu 7-Plex tahlilindeki ECL-IAA testi, serum örneklerinin asit muamelesini gerektirdiğinden, her serum, bu 7-Plex testi için etiketli antijen karışımı ile inkübe edilmeden önce asit tedavi adımını gerektirir.
<ol><li>96 kuyucuklu bir PCR plakası için kuyucuk başına 15 μL serum aliquot. Her bir kuyucuğa 18 μL 0,5 M asetik asit ekleyin ve karıştırın. RT'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Her bir kuyucuğa yeni bir 96 delikli PCR plakası ve aliquot 35 μL antijen çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>Plaka hala inkübe halindeyken, antijen plakasındaki her kuyucuğa 13 μL 1 M Tris pH 9.0 tamponu ekleyin. Tris tamponu ve antijenin karışmasını sınırlamak için her bir kuyucuğun yanına tampon ekleyin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, asitle muamele edilmiş serumun 25 μL'sini alın ve hemen antijen plakasındaki her bir oyuğa pipetleyin. Çözeltiyi çalkalayın ve ışığa maruz kalmayı önlemek için plakayı PCR sızdırmazlık folyosu ile örtün.</li>
	<li>RT'de, plakayı 1 saat boyunca düşük bir hızda ayarlanmış bir çalkalayıcıya koyun. Daha sonra, plakayı 4 ° C'de saklayın ve plakanın 18-24 saat kuluçkaya yatmasına izin verin.</li>
</ol>6. Multipleks plakayı hazırlayın
<ol><li>4 °C buzdolabından bir multipleks plaka alın ve plakanın RT'ye gelmesine izin verin. Multipleks plaka RT'ye ulaştığında, her bir kuyucuğa 150 μL% 3 Bloker A ekleyin. Multipleks plakayı sızdırmazlık folyosu ile örtün. Plakayı gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında kuluçkaya yatırın. NOT: Tahlil Günü 1, 4 ile 6 arasındaki adımları içerir.</li>
</ol>7. Serum/antijen inkübatörlerini multipleks plakaya aktarın
<ol><li>Ertesi gün, kağıt havluları masaya yerleştirin ve inkübasyon multipleks plakasını buzdolabından alın. Arabelleğin tamamını plakadan boşaltın. Bunu yapmak için, plakayı baş aşağı çevirin ve kuyucukların hiçbirinde tampon bulunmayana kadar hazırlanan kağıt havluların üzerine yerleştirin.</li>
	<li>Multipleks plakayı her kuyucuğa 150 μL PBST ekleyerek yıkayın. Adım 7.1.'de belirtildiği gibi arabelleği atın ve bu adımı üç kez yineleyin. Multipleks plakadaki her kuyucuğa 30 μL serum/antijen inkübe ekleyin. Işığa maruz kalmasını sınırlamak için plakayı folyo ile örtün. Plakayı, RT'de 1 saat boyunca düşük bir hıza ayarlanmış bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin.</li>
</ol>8. Plakayı yıkayın ve okuma tamponu ekleyin
<ol><li>Serum/antijen inkübatlarını multipleks plakadan plakayı baş aşağı tutarak ve çözeltiyi dışarı doğru iterek çıkarın. Tüm kuyucuklara 150 μL PBST ekleyin ve plakayı tekrar baş aşağı tutarak ve çözeltiyi dışarı atarak tamponu plakadan çıkarın. Bu adımı üç kez yineleyin. Üçüncü yıkama tamamlandıktan sonra, her bir oyuğa 150 μL Okuma tamponu ekleyin. NOT: Hava kabarcıkları, plaka okuyucu makinesinin plakanın sonuçlarını doğru bir şekilde analiz etme yeteneğine müdahale eder ve ne pahasına olursa olsun kaçınılmalıdır.</li>
</ol>9. Plakayı okuyun ve verileri analiz edin
<ol><li>Hazırlanan plakayı plaka okuyucu makinesinde sayın, tüm değerleri saniye başına sayım (CPS) cinsinden okuyun.</li>
	<li>Plaka okuyucu makinesinden elde edilen antikor seviyelerini kullanarak tahlil için göreceli indeksi aşağıdaki denklemle hesaplayın: Dizin değeri = [CPS (örnek) - CPS (negatif standart)] / [CPS (pozitif standart) - CPS (negatif standart)].</li>
	<li>Oluşturulan kesikleri kullanarak hangi antikor sonuçlarının negatif veya pozitif olduğunu belirleyin. NOT: Tahlil Günü 2, 7'den 9'a kadar olan adımları içerir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Harjutsalo, V., Sjoberg, L., Tuomilehto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+trends+in+the+incidence+of+type+1+diabetes+in+Finnish+children:+a+cohort+study.">Time trends in the incidence of type 1 diabetes in Finnish children: a cohort study.</a> Lancet. 371 (9626), 1777-1782 (2008).</li><li>Vehik, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+incidence+of+type+1+diabetes+in+0-+to+17-year-old+Colorado+youth.">Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth.</a> Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).</li><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+diabetes.">Type 1 diabetes.</a> Lancet. 383 (9911), 69-82 (2014).</li><li>Insel, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+presymptomatic+type+1+diabetes:+a+scientific+statement+of+JDRF,+the+Endocrine+Society,+and+the+American+Diabetes+Association.">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li><li>Barker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody+"subspecificity"+in+type+1+diabetes:+risk+for+organ-specific+autoimmunity+clusters+in+distinct+groups.">Autoantibody "subspecificity" in type 1 diabetes: risk for organ-specific autoimmunity clusters in distinct groups.</a> Diabetes Care. 28 (4), 850-855 (2005).</li><li>Triolo, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Additional+Autoimmune+Disease+Found+in+33%+of+Patients+at+Type+1+Diabetes+Onset.">Additional Autoimmune Disease Found in 33% of Patients at Type 1 Diabetes Onset.</a> Diabetes Care. 34 (5), 1211-1213 (2011).</li><li>de Graaff, L. C., Smit, J. W., Radder, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+clinical+significance+of+organ-specific+autoantibodies+in+type+1+diabetes+mellitus.">Prevalence and clinical significance of organ-specific autoantibodies in type 1 diabetes mellitus.</a> Netherlands Journal of Medicine. 65 (7), 235-247 (2007).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinsulin/Insulin+autoantibodies+measured+with+electrochemiluminescent+assay+are+the+earliest+indicator+of+prediabetic+islet+autoimmunity.">Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity.</a> Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinguishing+persistent+insulin+autoantibodies+with+differential+risk:+nonradioactive+bivalent+proinsulin/insulin+autoantibody+assay.">Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay.</a> Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).</li><li>Miao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GAD65+autoantibodies+detected+by+electrochemiluminescence+assay+identify+high+risk+for+type+1+diabetes.">GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes.</a> Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).</li><li>Gu, Y., Zhao, Z., High, H., Yang, T., Yu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+Autoantibody+Detection+by+Electrochemiluminescence+(ECL)+Assay.">Islet Autoantibody Detection by Electrochemiluminescence (ECL) Assay.</a> Journal of Clinical &amp; Cellular Immunology. 8 (6), (2017).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescence+Assays+for+Human+Islet+Autoantibodies.">Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57227 (2018).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+multiplexed+autoantibody+detection+to+screen+type+1+diabetes+and+multiple+autoimmune+diseases+simultaneously.">High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously.</a> Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).</li><li>Dongmei, M., A, K. S., Li Zh, K., Michelle, G., Ling, J., Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrochemiluminescence+Assays+for+Insulin+and+Glutamic+Acid+Decarboxylase+Autoantibodies+Improve+Prediction+of+Type+1+Diabetes+Risk.">Electrochemiluminescence Assays for Insulin and Glutamic Acid Decarboxylase Autoantibodies Improve Prediction of Type 1 Diabetes Risk.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).</li><li>Steck, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL-IAA+and+ECL-GADA+Can+Identify+High-Risk+Single+Autoantibody-Positive+Relatives+in+the+TrialNet+Pathway+to+Prevention+Study.">ECL-IAA and ECL-GADA Can Identify High-Risk Single Autoantibody-Positive Relatives in the TrialNet Pathway to Prevention Study.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).</li><li>Fouts, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+Electrochemiluminescence+Assays+Improve+Prediction+of+Time+to+Type+1+Diabetes+in+Autoantibody-Positive+TrialNet+Subjects.">Do Electrochemiluminescence Assays Improve Prediction of Time to Type 1 Diabetes in Autoantibody-Positive TrialNet Subjects.</a> Diabetes Care. 39 (10), 1738-1744 (2016).</li><li>Sosenko, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Use+of+Electrochemiluminescence+Assays+to+Predict+Autoantibody+and+Glycemic+Progression+Toward+Type+1+Diabetes+in+Individuals+with+Single+Autoantibodies.">The Use of Electrochemiluminescence Assays to Predict Autoantibody and Glycemic Progression Toward Type 1 Diabetes in Individuals with Single Autoantibodies.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 19 (3), 183-187 (2017).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher+Sensitivity+and+Earlier+Identification+of+Celiac+Disease+Autoimmunity+by+a+Nonradioactive+Assay+for+Transglutaminase+Autoantibodies.">Higher Sensitivity and Earlier Identification of Celiac Disease Autoimmunity by a Nonradioactive Assay for Transglutaminase Autoantibodies.</a> Journal of Immunology Research. 2016, 5 (2016).</li><li>Zhang, B., Kumar, R. B., Dai, H., Feldman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+plasmonic+chip+for+biomarker+discovery+and+diagnosis+of+type+1+diabetes.">A plasmonic chip for biomarker discovery and diagnosis of type 1 diabetes.</a> Nature Medicine. 20 (8), 948-953 (2014).</li><li>Tsai, C. T., Robinson, P. V., Spencer, C. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+Antibody+Detection+by+Agglutination-PCR+(ADAP).">Ultrasensitive Antibody Detection by Agglutination-PCR (ADAP).</a> American Chemical Society Central Science. 2 (3), 139-147 (2016).</li><li>Yim, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four-color+alternating-laser+excitation+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+for+next-generation+biodetection+assays.">Four-color alternating-laser excitation single-molecule fluorescence spectroscopy for next-generation biodetection assays.</a> Clinical chemistry. 58 (4), 707-716 (2012).</li><li>Bale, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+microsphere-based+assay+for+early+detection+of+Type+I+diabetes.">A highly sensitive microsphere-based assay for early detection of Type I diabetes.</a> Technology. 02 (03), 200-205 (2014).</li><li>Ziegler, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+Screen+ELISA+for+High-Throughput+Detection+of+Beta+Cell+Autoantibodies+in+Capillary+Blood.">3 Screen ELISA for High-Throughput Detection of Beta Cell Autoantibodies in Capillary Blood.</a> Diabetes Technology &amp; Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).</li><li>Schlosser, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+Antibody+Standardization+Program:+evaluation+of+assays+for+insulin+autoantibodies.">Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for insulin autoantibodies.</a> Diabetologia. 53 (12), 2611-2620 (2010).</li><li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+assay+combining+insulin,+GAD,+IA-2+and+transglutaminase+autoantibodies+to+facilitate+screening+for+pre-type+1+diabetes+and+celiac+disease.">A multiplex assay combining insulin, GAD, IA-2 and transglutaminase autoantibodies to facilitate screening for pre-type 1 diabetes and celiac disease.</a> Journal of Immunological Methods. 430, 28-32 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Tip 1 diyabet için çok sayıda ulusal ve uluslararası klinik çalışmada, çölyak hastalığı için adacık otoantikorlarını ve transglutaminaza (TGA) otoantikorlarını tespit etmek için tek ECL testinin performansı 8,9,10,11 olarak kanıtlanmıştır. Bu izler boyunca, bu tahlil, mevcut 'altın' standart RBA'ya göre değerlendirildiğinde otoantijen tespiti için duyarlılığı ve özgüllüğü arttırmıştır. Geliştirilmiş hastalık özgüllüğü, tek ECL testi ile RBA14,15,16,17 arasında, düşük riskli, düşük afiniteli sinyallerden yüksek afiniteli ve yüksek riskli adacık otoantikorları ayırt edildiğinde görülebilir. Tek ECL testine dayanarak, T1D'nin yanı sıra aynı anda uygulanabilir birkaç otoimmün hastalığı taramamızı sağlamak için yeni bir yüksek verimli çoklanmış ECL otoantikor testi sunuyoruz.
Multipleks ECL testi, 10 adede kadar otoantikor testini tek bir kuyucukta birleştirebilen multipleks plakayı kullanır. Bu çalışmada 7 otoantikor testi bir araya getirilmiştir. Otoantikorlar 3 IAbs (IAA, GADA ve IA-2A), 2 otoimmün tiroid hastalığı otoantikorları (TPOA ve ThGA), çölyak hastalığı otoantikorları (TGA) ve interferon alfaya (IFNαA) karşı APS-1 otoantikorlarından oluşur. Tahlil mekanizması, genel olarak, daha önce yayınlanmışolan 9,10,12,18 gibi bazı değişikliklerle tek bir ECL testine dayanmaktadır. Multipleks ECL testinin tek bir ECL tahlilinden temel farkı, sıvı fazında oluşan her bir antikor-antijen kompleksinin spesifik bir bağlayıcıya kısıtlanmasıdır (Şekil 1). Biyotin etiketli antijen, spesifik bir antijen-bağlayıcı kompleksi oluşturmak için kullanılan bir bağlayıcı olan Streptavidin konjuge ile inkübe edilir. Antikor-antijen immün kompleksi, hasta serumu ile inkübasyondan sonra oluşur ve multipleks plakanın her bir kuyucuğundaki spesifik bağlayıcı sistem aracılığıyla belirli bir noktaya yakalanır. Aynı zamanda antikorlar tarafından yakalanan Ru Sulfo-NHS etiketli antijen, elektrokemilüminesans ile sinyal sağlar. Plaka okuyucu makinesi, her bir kuyuda bulunan nokta kaynaklarından 10 adede kadar farklı sinyal algılayabilir. Otoantikor tahlillerini plakalar arasında tutarlı tutmak için ve uzun süreli çalışmalar yürütürken, aynı bağlayıcının kullanılmasını öneriyoruz.
Bir multipleks ECL testi yapmadan önce, her otoantikor için tek ECL tahlillerinin sırasıyla bir multipleks plaka üzerinde optimize edilmesi ve normal bir ECL plakasında hem RBA hem de tek ECL tahlillerine karşı doğrulanması gerekir. Dama tahtası testini arttırmak için, multipleks plaka üzerindeki ilgili otoantikor tahliline, yüksek pozitif hasta ve negatif hasta örneği kullanıldı. Dama tahtası testi yapıldıktan sonra, Ru Sulfo-NHS için en ideal konsantrasyonlar ve 7 otoantikor testinin her biri için hesaplanan biyotin etiketli antijen. Aşağıdaki konsantrasyonlar bu konsantrasyonları göstermektedir: GAD65 için 30 ng/mL ve 200 ng/mL, proinsülin için 120 ng/mL ve 120 ng/mL, IA-2 için 10 ng/mL ve 42 ng/mL, TG için 80 ng/mL ve 80 ng/mL, TPO için 8 ng/mL ve 16 ng/mL, ThG için 31 ng/mL ve 31 ng/mL, ve IFNα 13 için sırasıyla 12 ng / mL ve12 ng / mL. Dama tahtası tahlilinden bazı antijenlerin konsantrasyonlarının, tüm tahlilleri bir araya getirdikten sonra gerçek multipleks testindeki sonuçlara göre daha da ayarlanması gerekebilir.
IAA mevcut multipleks ECL testine dahil edildiğinden, önceki çalışmada bildirildiği gibi serum antijen ile inkübe edilmeden önce serum örneklerinin asit tedavisi zorunludur12. Genel olarak, bir multipleks testine ekstra bir otoantikor eklendiğinde, tahlil arka planı etkilenir ve kuyudaki bir noktadan gelen son derece yüksek bir sinyal, çapraz konuşma yoluyla yakındaki noktaların sonuçlarını engelleyebilir. Bu nedenle, maksimum CPS'nin her bir otoantikor için 20.000 sayımla veya en yüksek pozitif numuneler için daha düşük sayımla sınırlandırılması gerekir. Bildiğimiz kadarıyla, ilgili çapraz konuşma miktarını azaltmak için, nokta haritasını tasarlarken, daha yüksek sayım sıklığına sahip noktalardan uzak, daha düşük bir arka plana sahip otoantikorlar ayrılmalıdır.
Test edilen bilinmeyen numuneler için doğru bir indeks hesaplamak için her tahlilde dahili olarak yüksek pozitifler ve negatif kontroller kullanılmıştır. Tahlilin duyarlılığını doğru bir şekilde değerlendirmek ve izlemek için, tahlilin üst sınırına yakın ayarlanmış düşük pozitif kontroller kullanılmıştır. Bu standart pozitif ve negatif kontroller, uzun süreli kullanım için toplu ve aliquot olarak oluşturulmuş ve tahliller arasındaki tutarlılık için -20 °C veya altında saklanmıştır. Kalite güvencesi amacıyla, numuneler her tahlilde iki kez çalıştırıldı ve her olumlu sonuç tekrar çalıştırıldı ve numune ertesi gün yeni bir ECL tahlilinde çalıştırılarak doğrulandı. Birinci ve ikinci doğrulayıcı tahlil ile herhangi bir anlaşmazlık varsa, üçüncü bir tahlil gerekliydi. Yapılan üç tahlilden, aynı fikirde olan iki tahlilin sonuçları (örneğin, +, + veya -,-), numunenin nihai sonucunu (pozitif veya negatif) belirledi.
Son on yılda, birçok çalışma grubu, büyük popülasyonları taramak için çoklu otoantikor tahlillerini tek bir kuyuda birleştirmek için multipleks yöntemini kullanarak yüksek verimli bir tahlil aramaktadır. Multipleks otoantikor tahlilleri 19,20,21,22 yapmak için farklı teknolojiler kullanan birkaç çalışma vardır, ancak T1D'yi incelerken mevcut 'altın' standart RBA'ya karşı duyarlılık ve özgüllük açısından bu testlerin hiçbiri için bir karşılaştırma yoktur. Kullanılan bu farklı platform türleri, uluslararası Islet Autoantibody Standardizasyon Programı (IASP) çalıştayı veya klinik çalışmalarda büyük kohortların test edilmesi yoluyla doğrulanmamıştır. Almanya'da yakın zamanda yapılan genel popülasyon tabanlı bir taramada, Kronus tarafından dağıtılan yüksek verimli kombine bir tahlil, 3 Ekran ICATM ELISA, çocukluk T1D23'ün erken teşhisini sağlamak için üç IAb, GADA, IA-2A ve ZnT8A'yı tespit etmek için birinci basamak tarama aracı olarak kullanılmaktadır. 3 Ekranlı ELISA testi, 3 ayrı kuyuda, büyük miktarda serum tüketen veya 3 tahlilin hepsinin karıştırıldığı tek bir kuyucukta 3 otoantikoru ölçer. 3 Ekranlı ELISA testinde bir kuyu pozitifse, üç otoantikordan hangisinin mevcut olduğunu ayırt edemez. Bu tahlilin en büyük dezavantajı IAA ölçümünü dahil edememesidir. ELISA tarafından gerçekleştirilen tüm IAA sonuçları, IASP atölyelerinde kanıtlandığı gibi, kabul edilebilir bir duyarlılığa ve özgüllüğe sahip değildir24. IAA genellikle ortaya çıkan ilk IAb'dir ve küçük çocuklar arasında yüksek prevalansı vardır. IAA ile IAb taraması çocuklar için gereklidir ve toplumdaki T1D riskini değerlendirmek için IAA olmadan bu taramanın yapılması kabul edilemez. Ek olarak, Kronus IAb kit testinin daha T1D hastalığına özgü olduğunu ve yüksek riski düşük riskli IAb'lerden ayırt edebildiğini gösteren yayınlanmış bir çalışma veya veri yoktur. Bu çalışmada 7-Plex ECL testi, T1D13'lü yeni tanı konmuş hastaların büyük bir kohortu kullanılarak doğrulandı. Mevcut standart RBA ve köklü tek ECL testi ile karşılaştırıldığında, 7-Plex testi aynı tahlil özgüllüğü ile% 100 pozitifliği koruyabilir (Tablo 4). Şu anda, standart RBA'ya paralel olarak 4-Plex ECL testi, devam eden büyük bir klinik araştırmaya uygulanmaktadır: Çocuklar için Otoimmünite Taraması (ASK) çalışması. Bu çalışma, Denver metropol bölgesinin genel popülasyonundaki çocukları T1D ve çölyak hastalığı açısından taramaktadır. ASK çalışmasında kullanılan standart RBA ile karşılaştırıldığında, multipleks ECL testi, tek ECL çalışması25'i kullanan önceki raporlarımızla aynı olan mükemmel duyarlılık ve daha yüksek bir hastalık özgüllüğü göstermektedir. Ayrıca, 4-Plex ECL tahlilimiz, ECL ve RBA için karşılık gelen 4 tek tahlille karşılaştırıldığında, işçilik, maliyet ve serum hacminde% 70 oranında belirgin bir azalma olduğunu göstermiştir. Çoklanmış ECL testini kullanarak, belirli bir klinik konumun ihtiyaçlarına özgü farklı otoimmün hastalıkları test etmek için her bir kuyuyu farklı otoantikorları (10'a kadar) temsil eden farklı sayılarla özelleştirebiliriz.
Bu çalışmada, multipleks plakayı kullanan çoklanmış bir ECL testi için gözlemlenen bazı sınırlamalar vardır. Antijenle inkübe edilen serumun son seyreltilmesi, tek bir kuyuda birleştirilen her bir otoantikor testi için en uygun koşulları sağlayacak şekilde ayarlanamaz. T1D hastalarından alınan dokuz numunenin (9/1026), belirli otoantikorlar için yanlış negatif bir sonuca sahip olduğu gözlendi. Yanlış negatiflerin 7'si TPOA ve 2'si 7-Plex ECL testinde ThGA içindi, ancak hem tek ECL testinde hem de RBA'da yüksek pozitif sonuçlar sergilendi (Şekil 2 ve 3). 9 numunenin tümünün daha fazla seyreltilmesinden sonra, multipleks plakada pozitif hale geldiler. Bu sonuç, 'prozon' fenomeni olarak tanımladığımız şeyden kaynaklanır. Bu fenomen, numunenin yanlış bir negatif sonuç göstermesine neden olur, çünkü yüksek antikor titreleri antijen-antikor kafeslerinin oluşumunu etkiler. Multipleks bir test hazırlarken, kombine otoantikorların her biri için çok yüksek titrelere sahip numunelerin, antijen inkübasyonu için serumun isteğe bağlı seyreltilmesini tanımlamak için ön testlerin yapılması önerilir. Alternatif olarak, benzer optimize edilmiş koşullara sahip otoantikor testleri, her otoantikor için en iyi tahlil duyarlılığının ve özgüllüğünün elde edildiği kombine bir tahlil oluşturmak üzere seçilmelidir. Bu çalışmada, sağlıklı normal kontrollerden 7 örnek (7/1022), 7-Plex testinde çoklu otoantikorlar için yanlış pozitiflerle sonuçlandı, ancak tek bir ECL testi ve RBA (Şekil 2 ve 3) çalıştırıldıktan sonra bu otoantikorların her iki tahlilde de negatif olduğu bulundu. Bu küçük numune alt kümesi için multipleks plakada meydana gelen bu yanlış pozitif sonuçların arkasındaki nedenler şu anda bilinmemektedir. Multipleks ECL testinin mevcut uygulaması için, pozitifliği doğrulamak için tüm pozitif numuneler, bu yanlış pozitif hatayı multipleks ECL testinden kaldıran karşılık gelen tek ECL testi ile tekrarlanır.

Tip 1 diyabet (T1D) çocukluk çağında en sık görülen ciddi kronik bir hastalıktır. Şu anda, Amerika Birleşik Devletleri'nde yaklaşık 1,4 milyon insan T1D'ye sahiptir; Çarpıcı bir şekilde, T1D insidansı dünya çapında her yıl% 3-5 oranında istikrarlı bir şekilde artmaktadır ve son yirmi yılda, özellikle küçük çocuklarda 1,2 oranında iki katına çıkmıştır. Kan dolaşımındaki adacık otoantikorları (IAbs) şu anda en güvenilir biyobelirteçtir. IAbs, klinik T1D'nin3 gelişmesinden yıllar önce ortaya çıkabilir. Günümüzde T1D tanı ve risk taramasında insülin (IAA), glutamat dekarboksilaz-65 (GADA), insülinoma antijeni-2 (IA-2A) ve çinko taşıyıcı-8'e (ZnT8A) karşı otoantikorlar dahil olmak üzere dört ana IAb yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu dört IAb, T1D gelişiminin tahmininde eşit derecede önemlidir. T1D'nin sınıflandırılması son zamanlarda hastalık evresi 1 4 olarak normal bir glukoz metabolizmasına sahip herhangi bir 4 IAb'nin ≥2'sinin varlığı olarak yeniden tanımlanmıştır.
Gençlerde Diyabet Otoimmünite Çalışmasında (DAISY), T1D riski altındaki dört çocuktan birinin adacık, çölyak, tiroid veya romatoid otoimmüniteye ilerlemesinin muhtemel olduğu ve daha çarpıcı bir şekilde, T1D tanısı alan hastaların yaklaşık% 40'ının sonunda ek bir otoimmün durum geliştirdiği ortaya çıkmıştır 5,6,7 . Otoantikorların tanımlanması bu otoimmün hastalıkların öngörülmesi ve teşhisi için gereklidir ve hastalar için daha iyi klinik bakım sağlamalıdır. Şu anda bu çoklu otoimmün koşulları taramanın kolay ve ucuz bir yolu yoktur. Tek bir otoantikor ölçümü ile standart radyo-bağlayıcı tahlil (RBA) kullanan mevcut tarama yöntemleri, büyük ölçekli bir tarama için zahmetli ve verimsizdir.
Burada, tek bir ECL tahlil platformu 8,9,10,11 kullanarak doğruladığımız yeni geliştirilen basit çoklanmış ECL testini açıklayacağız. Multipleks ECL testi, sadece 15 μL serum kullanarak 7 otoantikor testini tek bir kuyucukta birleştirir ve çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve APS-1 dahil olmak üzere T1D ve çoklu ilgili otoimmün hastalıkları aynı anda tarayabilir. Bir ZnT8A ECL testi o sırada geliştirilmemişti ve çoklanmış tahlilde yer almadı. Multipleks ECL testi, T1D ve çoklu otoimmün hastalıklar için genel popülasyon taramasında yüksek verim için mükemmel bir araç sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4 &#176;C refrigerator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#8211;80 &#176;C and -20 &#176;C freezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Plate Shaker</td>
			<td>Wallac - Delfi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom plate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>8408220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid solution</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigen proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human GAD65 full length protein</td>
			<td>Diamyd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human ThG full length protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human TPO full length protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IA-2 intracellular domain protein</td>
			<td>BioMart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#945; protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proinsulin protein</td>
			<td>AmideBio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tTG protein</td>
			<td>DiaRect</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-Top 500 mL , Filter Units</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>0974064A or B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled deionized (DD) water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice maker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice trays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Sector</td>
			<td>Perkin-Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper tower</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette-Aid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes/tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ru Sulfo-NHS</td>
			<td>MSD (R91AN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uplex Development Kit</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well UPlex plate</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocker A</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R93AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linker-Streptavidin</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Read buffer</td>
			<td>MSD</td>
			<td>R92TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop Solution</td>
			<td>MSD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZeBa Column</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>89892</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases

Adacık otoantikorları (IAbs) tip 1 diyabet (T1D) tanı ve tahmininde yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsülin (IAA), glutamat dekarboksilaz-65 (GADA), insülinoma antijeni-2 (IA-2A) ve çinko taşıyıcı-8 (ZnT8A) olmak üzere dört ana IAb, hastalık tahmininde eşit derecede önemlidir. Halen, T1D tanısı alan hastaların% 40'ına kadarı diğer otoimmün bozuklukları geliştirmeye devam etmektedir. Ne yazık ki, ölçüm için tek bir otoantikor kullanan mevcut tarama yöntemleri, büyük ölçekli tarama çalışmaları için zahmetli ve verimsizdir. Yakın zamanda bu güncel sorunları ele almak için basit bir çoklanmış elektrokemilüminesans (ECL) testi geliştirdik. Tahlil, 7 otoantikor testinin tümünü tek bir kuyuda birleştirir. Her kuyucuk üç IAb (IAA, GADA ve IA-2A), otoimmün tiroid hastalığını tespit etmek için tiroid peroksidaz (TPOA) ve tiroid globuline (ThGA) karşı otoantikorlar, çölyak hastalığı için doku transglutaminazına (TGA) otoantikorlar ve otoimmün poliglandüler sendrom-1 (APS-1) için interferon alfaya (IFN�A) otoantikorlar içerir; bunların hepsi aynı anda T1D ve diğer ilgili otoimmün hastalıkları tarar. Multipleks ECL testi, tek ECL tahlil platformuna dayanır, ancak bunun yerine, 10'a kadar çoklu otoantikor tahlillerini tek bir kuyucukta birleştiren multipleks plakayı kullanır. Tek ECL tahlilinden temel farkı, sıvı fazında oluşan her antikor-antijen kompleksinin, multipleks plaka üzerindeki bir bağlayıcı sistem aracılığıyla her bir kuyucukta belirli bir noktaya tutulmasıdır. Bu çalışmada 7-Plex ECL testi, yeni teşhis edilen T1D hastalarının büyük bir kohortu ve yaşa uygun sağlıklı kontroller kullanılarak standart radyo-bağlayıcı testlere (RBA) ve tek ECL tahlillerine karşı doğrulanmıştır ve bu da mükemmel tahlil duyarlılığı ve özgüllüğü ile sonuçlanmıştır.

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases at JoVE.com

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

7 otoantikor testini bir araya getiren basit bir çoklanmış ECL testi modelliyoruz. Tahlil, çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve otoimmün poliglandüler sendrom 1 dahil olmak üzere T1D ve diğer birçok otoimmün hastalığı aynı anda tarayabilir.

Yüksek Verimli Bir Elektrokemilüminesans 7-Plex Testi Aynı Anda Tip 1 Diyabet ve Çoklu Otoimmün Hastalıklar İçin Tarama

Islet autoantibodies (IAbs) are widely used in type 1 diabetes (T1D) diagnosis and prediction. Four major IAbs to insulin (IAA), glutamate ...

a-high-throughput-electrochemiluminescence-7-plex-assay

Research

JoVE Journal

Medicine

2.3K Görüntüleme.  University of Colorado School of Medicine. 7 otoantikor testini bir araya getiren basit bir çoklanmış ECL testi modelliyoruz. Tahlil, çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve otoimmün poliglandüler sendrom 1 dahil olmak üzere T1D ve diğer birçok otoimmün hastalığı aynı anda tarayabilir.

Video: A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Tıp

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be addressed as a matter of great urgency1-4. Multiple complementary 'omics' approaches have provided clues as to the genetic risk factors and pathogenic mechanisms underlying numerous neurodegenerative diseases, but most findings still require functional validation5. For example, a recent genome wide association study for Parkinson's Disease (PD), identified many new loci as risk factors for the disease, but the underlying causative variant(s) or pathogenic mechanism is not known6, 7. As each associated region can contain several genes, the functional evaluation of each of the genes on phenotypes associated with the disease, using traditional cell biology techniques would take too long. 
	There is also a need to understand the molecular networks that link genetic mutations to the phenotypes they cause. It is expected that disease phenotypes are the result of multiple interactions that have been disrupted. Reconstruction of these networks using traditional molecular methods would be time consuming. Moreover, network predictions from independent studies of individual components, the reductionism approach, will probably underestimate the network complexity8. This underestimation could, in part, explain the low success rate of drug approval due to undesirable or toxic side effects. Gaining a network perspective of disease related pathways using HT/HC cellular screening approaches, and identifying key nodes within these pathways, could lead to the identification of targets that are more suited for therapeutic intervention.
	High-throughput screening (HTS) is an ideal methodology to address these issues9-12. but traditional methods were one dimensional whole-well cell assays, that used simplistic readouts for complex biological processes. They were unable to simultaneously quantify the many phenotypes observed in neurodegenerative diseases such as axonal transport deficits or alterations in morphology properties13, 14. This approach could not be used to investigate the dynamic nature of cellular processes or pathogenic events that occur in a subset of cells. To quantify such features one has to move to multi-dimensional phenotypes termed high-content screening (HCS)4, 15-17. HCS is the cell-based quantification of several processes simultaneously, which provides a more detailed representation of the cellular response to various perturbations compared to HTS. 
	HCS has many advantages over HTS18, 19, but conducting a high-throughput (HT)-high-content (HC) screen in neuronal models is problematic due to high cost, environmental variation and human error. In order to detect cellular responses on a 'phenomics' scale using HC imaging one has to reduce variation and error, while increasing sensitivity and reproducibility. 
	Herein we describe a method to accurately and reliably conduct shRNA screens using automated cell culturing20 and HC imaging in neuronal cellular models. We describe how we have used this methodology to identify modulators for one particular protein, DJ1, which when mutated causes autosomal recessive parkinsonism21. 
	Combining the versatility of HC imaging with HT methods, it is possible to accurately quantify a plethora of phenotypes. This could subsequently be utilized to advance our understanding of the genome, the pathways involved in disease pathogenesis as well as identify potential therapeutic targets.

We describe a methodology combining automated cell culturing with high-content imaging to visualize and quantify multiple cellular processes and structures, in a high-throughput manner. Such methods can aid in the further functional annotation of genomes as well as identify disease gene networks and potential drug targets.

Nörodejeneratif Hastalıklar Yüksek İçerik Tarama

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. Urinary exosome vesicles, 40-100 nm in size, are released into the urine under normal conditions by cells from all nephron segments and may contain protein, mRNA and microRNA representative of their cell type of origin. Under conditions of renal dysfunction or injury, exosomes may contain altered proportions of these components, which may serve as biomarkers for disease. There are currently several methods available for isolation of urinary exosomes, and we have previously conducted an experimental comparison of each of these approaches, including three based on ultracentrifugation, one using a nanomembrane ultrafiltration concentrator, one using a commercial precipitation reagent and one using a modification of the precipitation technique using ExoQuick reagent that we developed in our laboratory. We found the modified precipitation method produced the highest yield of exosome particles, miRNA, and mRNA, making this approach suitable for the isolation of exosomes for subsequent RNA profiling. We conclude that the modified exosome precipitation method offers a quick, scalable, and effective alternative for the isolation of exosomes from urine. In this report, we describe our modified precipitation technique using ExoQuick reagent for isolating exosomes from human urine.

This manuscript describes a protocol for isolating exosomes from human urine using a modified precipitation technique.

Bir Modifiye Yağış Yöntemi İdrar eksozomlar yalıtmak için

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Primer Multipl Miyelom Hücrelerinin İlaç Duyarlılık Karakterizasyonu için bir Organotipik Yüksek Verimli Sistemi

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

TRUE Gene Silencing: Screening of a Heptamer-type Small Guide RNA Library for Potential Cancer Therapeutic Agents

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes an artificial small guide RNA (sgRNA) to guide tRNA 3&#8242; processing endoribonuclease, tRNase ZL, to recognize a target RNA. sgRNAs can be taken up by cells without any transfection reagents and can downregulate their target RNA levels and/or induce apoptosis in human cancer cells. We have screened an sgRNA library containing 156 heptamer-type sgRNAs for the effect on viability of human myeloma and leukemia cells, and found that 20 of them can efficiently induce apoptosis in at least one of the cancer cell lines. Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers. The protocol includes how to construct the sgRNA library, how to assess the effect of each sgRNA on cell viability, and how to further evaluate the effective sgRNAs by flow cytometry. Around 2,000 hits would be expected to be obtained by screening the full-scale sgRNA library composed of 16,384 heptamers.

Here we present a protocol for screening of a heptamer-type sgRNA library for potential therapeutic drugs against blood cancers.

DOĞRU gen susturma: Potansiyel Kanser Tedavi Ajanlar için heptamer tipi Küçük Rehberi RNA Kütüphanesi Taranması

TRUE gene silencing (termed after tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing) is one of the RNA-directed gene silencing technologies, which utilizes ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Bir Yüksek Verimli, Çoklanmış ve Hedefli Proteomik BOS Deneyi nörodejeneratif Biyomarkerleri ve Apolipoprotein E İzoformları Durum belirlememize

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Yüksek işlem hacmi Nitrobenzoxadiazole etiketli kolesterol sızma tahlil

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay formats are currently in use worldwide so there is a need for an accurate and high-throughput method for measuring RSV NAbs. We describe here an imaging-based micro-neutralization assay that has been tested on RSV subgroup A and can also be adapted for RSV subgroup B and different sample types. This method is highly reproducible, with inter-assay variations for the reference antiserum being less than 10%. We believe this assay can be readily established in many laboratories worldwide at relatively low cost. Development of an improved, high-throughput assay that measures RSV NAbs represents a significant step forward for the standardization of this method internationally as well as being critical for the evaluation of novel RSV vaccine candidates in the future.

An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus RSV Micro-neutralization Assay

This study describes a high throughput, imaging-based micro-neutralization assay to determine the titer of neutralizing antibodies specific for respiratory syncytial virus (RSV). This assay format has been tested on different sample types.

Bir geliştirilmiş ve yüksek üretilen iş respiratuvar sinsityal virüs (RSV) mikro-nötralizasyon tahlil

Respiratory syncytial virus-specific neutralizing antibodies (RSV NAbs) are an important marker of protection against RSV. A number of different assay ...

High-Throughput Analysis of Optical Mapping Data Using ElectroMap

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we present, in a step-by-step guide, the use of ElectroMap for analysis, quantification, and mapping of high-resolution voltage and calcium datasets acquired by optical mapping. ElectroMap analysis options cover a wide variety of key electrophysiological parameters, and the graphical user interface allows straightforward modification of pre-processing and parameter definitions, making ElectroMap applicable to a wide range of experimental models. We show how built-in pacing frequency detection and signal segmentation allows high-throughput analysis of entire experimental recordings, acute responses, and single beat-to-beat variability. Additionally, ElectroMap incorporates automated multi-beat averaging to improve signal quality of noisy datasets, and here we demonstrate how this feature can help elucidate electrophysiological changes that might otherwise go undetected when using single beat analysis. Custom modules are included within the software for detailed investigation of conduction, single file analysis, and alternans, as demonstrated here. This software platform can be used to enable and accelerate the processing, analysis, and mapping of complex cardiac electrophysiology.

This protocol describes the setup and use of ElectroMap, a MATLAB-based open-source software platform for analysis of cardiac optical mapping data. ElectroMap provides a versatile high-throughput tool for analysis of optical mapping voltage and calcium datasets across a wide range of cardiac experimental models.

Elektromap kullanarak optik haritalama verilerinin yüksek verim Analizi

Optical mapping is an established technique for high spatio-temporal resolution study of cardiac electrophysiology in multi-cellular preparations. Here we ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

Farelerde Hepatosit Nükleer Ploidi Tahmini için Yerinde Yüksek Throughput Yöntemi

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...