Cette procédure permet aux chercheurs d’évaluer et de sélectionner des nanoparticules optimales pour des études sur de grands animaux et des essais cliniques. Cette méthode simple permet de déterminer si la nanoparticule peut cibler les cellules cancéreuses humaines in vivo et si oui, l’efficacité du ciblage est. Le Dr Xiodan Qin, postdoc, et M. Andrew Lam, technicien de recherche de notre laboratoire, démontreront les procédures.
Remplissez deux réservoirs d’accouplement de chambre avec de l’eau de poisson le soir et séparez les réservoirs supérieurs à l’aide de séparateurs. Placez un poisson zèbre mâle dans un côté de la chambre et un ou deux femelles poisson zèbre dans un autre côté de la chambre. Retirez les séparateurs à 8 h le lendemain matin.
Ajouter les plantes d’enrichissement artificiel et incliner légèrement la chambre supérieure pour créer une zone d’eau peu profonde. Laissez le poisson zèbre se reproduire pendant trois à quatre heures et recueillez les œufs de la chambre inférieure en versant l’eau à travers un filet de maille. Transférer les œufs dans une boîte de Pétri avec pas plus de 200 œufs par plat.
Retirer les œufs morts ou non fécondés. Remplissez le plat des deux tiers avec de l’eau de poisson fraîche et placez-le dans l’incubateur. Après 24 heures, retirer le plat de l’incubateur et retirer le plus d’eau possible du plat.
Ajouter quelques gouttes d’un milligramme par solution de pronase millilitre et faire tourbillonner doucement le plat. Lorsque les chorions montrent des signes de désintégration, pipette les embryons de haut en bas à quelques reprises pour décomposer les chorions et libérer les embryons. Une fois que la majorité des embryons sont hors des chorions, ajouter immédiatement de l’eau de poisson frais pour mettre fin au processus.
Rincer les embryons à l’eau de poisson trois fois pour enlever les chorions flottants Retourner les embryons à l’incubateur. Faire une solution de 3% agarose en ajoutant trois grammes d’agarose de qualité électrophorèse à 100 millilitres d’eau de poisson autoclavée. Cuire au micro-ondes l’agarose et l’eau jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
Pour créer la plaque d’injection, verser la solution d’agarose chaude dans une boîte de Pétri jusqu’à ce qu’elle soit pleine aux trois quarts et placer le moule à micro-injection sur l’agarose. Après que l’agarose se soit solidifiée, retirez soigneusement le moule. Remplissez la plaque d’injection qui en résulte d’eau de poisson autoclavée et rangez-la à quatre degrés Celsius.
Pour fabriquer les aiguilles d’injection, tirez les capillaires en verre borosilicate d’un millimètre de diamètre extérieur de 0,78 millimètre sur un puller pipette. Conservez les aiguilles d’injection sur du mastic dans une grande boîte de Pétri qui a été essuyée avec une serviette en éthanol. Avant de récolter les cellules HeLa, réchauffer la plaque d’injection et l’eau de poisson dans l’incubateur à 35,5 degrés Celsius.
30 minutes à une heure avant la transplantation, récolter les cellules HeLa. En travaillant dans une hotte de culture tissulaire, retirez le milieu du flacon par aspiration. Rincer les cellules avec du PBS stérile pour enlever toutes les traces du milieu.
Ajouter trois millilitres de trypsine stérile EDTA au flacon et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes. Observez le flacon au microscope pour suivre l’évolution de la digestion enzymatique. Lorsqu’environ 80 % des cellules sont suspendues, ajouter de six à huit millilitres de milieu de croissance au flacon.
Recueillir les cellules en pipetant doucement et les transférer dans un tube stérile de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 135 fois G pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules HeLa en trois millilitres de milieu de croissance complet.
Après avoir répété les étapes de lavage deux fois, resuspendez les cellules en un millilitre de milieu de croissance complet. Comptez ensuite les cellules au microscope à l’aide d’un hémocytomètre. Après avoir centrifugé les cellules à nouveau, enlever le supernatant.
Resuspendez les cellules dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre à une concentration de cinq fois 10 à la septième cellule par millilitre. Gardez les cellules au chaud en tenant le tube dans une main lors du transport à l’installation de pêche. À l’aide d’une pipette en plastique, déposer les embryons de poisson zèbre sur la plaque d’injection.
Déposer les embryons sur leurs côtés avec l’avant antérieur orienté vers l’avant aligné sur les rainures de la plaque. Allumez la source d’air et le micro-injecteur. Après avoir récupéré les cellules HeLa de l’incubateur, pipette les cellules de haut en bas 20 à 30 fois à l’aide d’un P200.
À l’aide d’une pointe de chargement de gel avec une extrémité coupée, chargez immédiatement trois microlitres de la suspension cellulaire HeLa dans l’une des aiguilles d’injection. Insérez l’aiguille dans le porte-aiguille et placez la plaque d’injection sous le microscope. Injecter le mélange cellulaire dans l’embryon à la zone vascularisée sous la cavité périvitelline en appuyant sur la pédale.
Puis pipette quelques gouttes d’eau de poisson stérile sur l’embryon. Pour poursuivre le processus d’injection, utilisez la main non dominante pour déplacer la plaque d’injection vers l’embryon suivant, puis utilisez la main dominante pour étendre et rétracter l’injecteur tout en appuyant simultanément sur la pédale. Terminer l’injection de tous les embryons dans l’assiette et laver les embryons avec de l’eau de poisson stérile dans une boîte de Pétri stérile.
Incuber immédiatement le plat à 35,5 degrés Celsius. Après trois heures, examiner les embryons injectés et enlever les embryons morts. Le lendemain, faire des aiguilles d’injection pour les nanoparticules et les stocker sur du mastic dans une grande boîte de Pétri.
En travaillant au microscope fluorescent, ramassez soigneusement les embryons avec des métastases de queue et placez-les sur une nouvelle plaque d’injection avec de l’eau de poisson stérile. Pour chaque poisson zèbre avec une métastase de queue, injectez soit une solution nanoparticule, soit de l’eau derrière l’œil. Injectez également une solution nanoparticule derrière les yeux du poisson zèbre du groupe témoin qui n’a pas reçu de greffes d’HeLa et a incubé tous les embryons injectés à 35,5 degrés Celsius.
Immédiatement après l’injection et de nouveau à intervalles de 30 à 60 minutes, transférez deux à trois embryons dans une boîte de Pétri et immobilisez-les en ajoutant cinq gouttes de solution MS222 diluée. Une fois que les embryons arrêtent de nager, retirez la majeure partie de l’eau pour permettre aux embryons de se trouver sur leurs côtés. À l’aide d’une pipette avec une fine brosse molle fixée à son extrémité, aligner les embryons de sorte qu’ils se trouvent avec l’antérieur orienté vers l’avant et un seul œil visible.
À l’aide du grossissement 2X, capturez des images de l’embryon entier sur des canaux rouges, bleus et brightfield. Pour capturer la zone de la queue, imagez les embryons au grossissement de 6,4 X. Concentrez l’embryon sous le canal rouge pour éviter le saignement des nanoparticules.
Immédiatement après l’imagerie, ajouter de l’eau de poisson frais aux embryons et les retourner à l’incubateur. Des embryons injectés et de contrôle de poisson zèbre ont été photographiés à l’aide d’un microscope fluorescent. Les points rouges sont des cellules métastatiques du cancer du col de l’utérus humain tandis que les points bleus représentent les nanoparticules.
Dans un groupe témoin, le poisson zèbre qui a été injecté avec des cellules cancéreuses mais pas des nanoparticules, les cellules fluorescentes d’HeLa étaient visibles dans le canal rouge et aucun signal fluorescent spécifique n’a été détecté dans le canal bleu. Dans l’autre groupe témoin, le poisson zèbre a été injecté avec des nanoparticules, mais pas avec des cellules cancéreuses. Des nanoparticules fluorescentes bleues ont été distribuées dans tout le système circulatoire.
Aucune florescence rouge spécifique n’était visible. Lorsque le poisson zèbre avec des métastases de queue a été injecté avec des nanoparticules, des images superposées des canaux rouges et bleus montrent la co-localisation des cellules HeLa et des nanoparticules. Après avoir effectué cette méthode, nous pouvons analyser la charge tumorale et la survie des cellules cancéreuses, les animaux avec et sans injection de nanoparticules pour ajuster leur capacité à tuer les cellules cancéreuses.
Cette technique peut faciliter la sélection de la nanoparticule optimale qui peut reconnaître spécifiquement la cellule cancéreuse in vivo menant à la détection précoce du cancer et de la métastase de cancer.
