Ce travail a été financé par des subventions des NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 et par T32 Training Grant 5T32GM081740

Tous les protocoles animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud.
1. Préparation de la solution d’élevage
<ol><li>Solution 1 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 2 mL de Triton X-100.</li>
	<li>Solution 2 (1 L) : À 900 mL de H2O désionisé, ajouter 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 et 1 mL de solution mère d’héparine de 10 mg/mL.</li>
	<li>Solution 3 (500 mL) : À 400 mL de la solution 1, ajouter 11,5 g de glycine et 100 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO).</li>
	<li>Solution 4 (50 mL) : À 42 mL de la Solution 1, ajouter 3 mL de sérum correspondant et 5 mL de DMSO.</li>
	<li>Solution d’anticorps primaires (50 mL) : À 46 mL de la solution 2, ajouter 2,5 mL de DMSO et 1,5 mL de sérum correspondant.</li>
	<li>Solution d’anticorps secondaires (50 mL) : À 48,5 mL de la solution 2, ajouter 1,5 mL de sérum correspondant. REMARQUE : Pour la solution 4, la solution primaire et la solution secondaire, utilisez un sérum qui correspond à l’anticorps secondaire (p. ex. chèvre, cheval, bovin).</li>
</ol>2. Préparation de l’échantillon
REMARQUE: Effectuer les étapes 2.1 à 2.7 dans une hotte de fumée afin de limiter l’exposition aux PFA.
<ol><li>Anesthésier profondément les jeunes rats (3-6 semaines) à l’aide de sévoflurane; passer à 2.2 lorsque le rat ne réagit pas et ne répond pas au pincement des orteils et de la queue.</li>
	<li>Posez le rat en position couchée et faites une incision à travers la paroi abdominale à l’aide d’une paire de ciseaux Iris.</li>
	<li>Coupez à travers le fond de la cage thoracique jusqu’à la clavicule des deux côtés de la cage thoracique à l’aide de ciseaux Mayo.</li>
	<li>Apposez le sternum et les côtes loin du cœur et des poumons avec un hémostat.</li>
	<li>Percer le ventricule gauche avec une aiguille de 23 G attachée à une pompe de perfusion et couper l’oreillette droite avec des ciseaux à iris.</li>
	<li>Effectuer une perfusion transcardique avec environ 75 mL de 100 mM (1x) PBS.</li>
	<li>Poursuivre la perfusion transcardique avec environ 100 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % tamponné dans 1x PBS.</li>
	<li>Retirez le cerveau du crâne à l’aide d’une pince.</li>
	<li>Placez le cerveau en position sagittale et coupez-le en 4 sections égales (environ 3 mm de largeur) à l’aide d’une lame de rasoir et d’une matrice cérébrale de rat.</li>
	<li>Fixez chaque section dans 4% de PFA dans 1x PBS dans un tube en plastique scellé de 5 ml pendant la nuit à 4 ° C sur un agitateur.</li>
	<li>Continuer à fixer 4% PFA dans 1x PBS à température ambiante (RT) sur un agitateur pendant 1 h.</li>
	<li>Lavez chaque section avec 1x PBS à RT pendant 30 min, 3 fois.</li>
</ol>3. Déshydratation et dépigmentation
<ol><li>Incuber l’échantillon dans une solution à 20 % de méthanol/80 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 40 % de méthanol/60 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 60 % de méthanol/40 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 80 % de méthanol/20 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans du méthanol à 100 % pendant 1 h à RT. Répéter avec plus de 100 % de méthanol, en incubant pendant 1 h à RT.</li>
	<li>Refroidir l’échantillon dans du méthanol à 100 % à 4°C pendant environ 10 min.</li>
	<li>Préparer une solution de dichlorométhane (DCM) à 66 % / méthanol à 33 %.</li>
	<li>Incuber l’échantillon pendant la nuit dans la solution de DCM/méthanol à TA, en agitant.</li>
	<li>Laver au méthanol à RT pendant 30 min, 2 fois.</li>
	<li>Refroidir l’échantillon dans du méthanol à 100 % à 4°C pendant environ 10 min.</li>
	<li>Eau de Javel dans du peroxyde d’hydrogène réfrigéré et fraîchement préparé à 5 % dans du méthanol pendant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 80 % de méthanol/20 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 60 % de méthanol/40 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 40 % de méthanol/60 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 20 % de méthanol/80 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans 1x PBS pendant 1 h à RT.</li>
	<li>Laver dans la solution 1 pendant 1 h à TA, 2 fois.</li>
</ol>4. Étiquetage de la sous-unité B de la toxine cholérique
<ol><li>Insérer l’extrémité de l’aiguille d’une seringue de 1 mL dans le site du noyau accumbens.</li>
	<li>Injecter lentement 2,5 μL de 1 % de biotine-CTB sur 20 s.</li>
	<li>Laissez la pointe de l’aiguille en place pendant 1 min et retirez-la lentement pendant 10 s pour éviter les fuites.</li>
</ol>5. Application d’anticorps
<ol><li>Incuber l’échantillon dans la Solution 3 pendant 2 jours à 37 °C au bain-marie.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans la Solution 4 pendant 2 jours à 37 °C au bain-marie.</li>
	<li>Incuber avec un anticorps primaire pendant 7 jours à 37 °C au bain-marie.</li>
	<li>Laver dans la solution 2 pendant 5 fois, incubation 1 h par lavage. Conserver dans la Solution 2 à RT pendant la nuit.</li>
	<li>Incuber avec un anticorps secondaire pendant 7 jours à 37 °C au bain-marie.</li>
	<li>Laver dans la solution 2 pendant 5 fois, incubation 1 h par lavage; stocker dans la Solution 2 à RT pendant la nuit. REMARQUE: Toutes les étapes à partir de la version 5.6, y compris le stockage final, doivent se produire en basse lumière. Les tubes d’échantillonnage peuvent être protégés avec du papier d’aluminium. Les concentrations utilisées pour les anticorps dans ce protocole étaient: TH à 1:100, Iba1 à 1:200 et l’anticorps secondaire à 1:100. Ajoutez la solution 2 supplémentaire aux étapes 5.1 à 5.6 pour vous assurer que les tubes sont complètement remplis.</li>
</ol>6. Nettoyage des tissus
<ol><li>Incuber l’échantillon dans une solution à 20 % de méthanol/80 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 40 % de méthanol/60 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 60 % de méthanol/40 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans une solution à 80 % de méthanol/20 % d’eau désionisée pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber l’échantillon dans du méthanol à 100% pendant 1 h à TA.</li>
	<li>Incuber dans du méthanol frais 100% pendant la nuit à RT.</li>
	<li>Incuber dans 66% de DCM/33% de méthanol pendant 3 h, avec agitation, à température ambiante.</li>
	<li>Incuber dans de l’éther dibenzylique (DBE) sans agitation. Laissez l’échantillon dans DBE jusqu’à ce qu’il soit clair et conservez-le dans DBE jusqu’à l’imagerie.</li>
</ol>7. Montage
<ol><li>Procurez-vous une chambre imprimée en 3D en résine Visijet M3 Crystal (modèles disponibles sur le site idisco.info).</li>
	<li>Fixez la chambre à une lame de microscope à l’aide d’un époxy.</li>
	<li>Placez l’échantillon dans l’espace carré au milieu de la chambre.</li>
	<li>Remplissez complètement la chambre avec DBE.</li>
	<li>Placez un couvercle de 0,17 mm d’épaisseur sur la chambre et appliquez une pression jusqu’à ce que le couvercle ait un contact complet avec les parois de la chambre.</li>
	<li>Scellez les bords du couvercle à la chambre à l’aide de l’époxy.</li>
	<li>Faites pivoter la chambre pour permettre aux bulles d’air de s’échapper de l’entrée de remplissage.</li>
	<li>Remplissez la chambre avec du DBE supplémentaire.</li>
	<li>Sceller l’entrée de remplissage avec de l’époxy et laisser durcir. REMARQUE: L’excès de DBE se répandra pendant le montage.</li>
</ol>8. Imagerie
<ol><li>Utilisez un système de microscope confocal pour effectuer un z-scan à un grossissement 4x (voir la vidéo 3Dci-jointe).</li>
	<li>Obtenir une excitation fluorescente de l’échantillon à l’aide d’un laser réglé pour émettre à une longueur d’onde similaire à la longueur d’onde spécifiée par l’anticorps secondaire. L’excitation TH a été réalisée à l’aide d’un laser HeNe réglé pour émettre à 632 nm.</li>
	<li>Réglez le détecteur sur une longueur d’onde proche de l’émission laser. Pour le protocole actuel, le détecteur pour TH a été réglé à 650 nm.</li>
	<li>Augmentez le gain du détecteur jusqu’à ce qu’il y ait un signal visible. Le gain de 650LP pour les images a été réglé sur 7,50 B.</li>
	<li>À l’aide de l’option Scan du logiciel d’imagerie confocale, déplacez l’étage du microscope jusqu’à ce que l’échantillon soit mis au point.</li>
	<li>Naviguez autour du tissu dans toutes les plaines et obtenez des images uniques ou des images z-stack à l’aide du logiciel d’imagerie confocale.</li>
	<li>Une fois l’imagerie terminée, retirez l’échantillon de la chambre. Replacez-le dans un tube complètement rempli de DBE et conservez-le à RT dans un endroit sombre, de préférence recouvert de papier d’aluminium. REMARQUE: Les échantillons peuvent être remontés et imagés tant que le signal de floraison est encore fort.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

Aucun des auteurs n’a de conflits d’intérêts à déclarer.

L’élimination des tissus offre une solution aux limites du protocole IHC traditionnel. Un échantillon transparent minimise la diffusion et l’absorption de la lumière, ce qui fournit un accès optique au niveau cellulaire aux tissus intacts18,19. Les techniques de nettoyage des tissus transforment un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification avec l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’écha...

Plusieurs techniques de nettoyage des tissus ont été validées pour une utilisation dans le cerveau : hydrogel, hydrophile et hydrophobe. Ces techniques visent à rendre un tissu transparent par délipidation, décoloration et décalcification via l’administration de solvants. Une fois que l’indice de réfraction de l’échantillon de tissu correspond à l’indice de réfraction du milieu d’imagerie choisi, une image claire de l’échantillon peut être obtenue. Les techniques à base d’hydrogel, telles que CLARITY, sécurisent les biomolécules dans les tissus en les reliant à des hydrogels à base d’acryl, ce qui empêche les dommages structurels et la perte de protéines1. Cependant, les techniques d’hydrogel utilisent des produits chimiques agressifs qui ont le potentiel d’endommager des tissus plus fragiles, et des échantillons de tissus plus denses peuvent ne pas être compatibles avec le protocole d’hydrogel. Certaines techniques d’hydrogel peuvent nécessiter un équipement coûteux ou entraîner une expansion des tissus. Les techniques hydrophiles, comme CUBIC, préservent la structure 3D par la formation de liaisons hydrogène dans le tissu2. L’expansion tissulaire peut également se produire dans certains protocoles hydrophiles. La capacité de nettoyage des techniques hydrophiles ne correspond souvent pas à la capacité des techniques hydrophobes, ce qui est important pour les tissus plus denses et plus épais3.
Les techniques hydrophobes sont généralement rapides, ne nécessitent pas d’équipement spécial et produisent un échantillon facile à manipuler et à stocker. iDISCO est une technique hydrophobe qui élimine le retrait qui peut se produire dans d’autres protocoles hydrophobes. À l’origine, la technique de nettoyage des tissus iDISCO a été décrite par Renier et al.4 pour les embryons et les organes adultes denses de souris. Cette technique élimine l’eau du tissu lors de l’étape initiale de déshydratation, réduisant ainsi la diffusion de la lumière. Le tissu est perméabilisé pendant le prétraitement pour permettre une pénétration profonde des anticorps. Les colorants Alexa Fluor dans le spectre rouge lointain sont utilisés pour l’immunomarquage afin d’éviter l’autofluorescence du tissu à des longueurs d’onde inférieures5. Les tissus qui ont subi des protocoles de nettoyage hydrophobes peuvent être manipulés facilement et peuvent être imagés plusieurs fois en raison de la longévité des colorants Alexa Fluor. S’ils sont correctement stockés, les tissus peuvent fournir des images pendant des mois à un an après le traitement initial.
Dans le présent protocole, l’anticorps tyrosine hydroxylase (TH), l’anticorps Iba1 et la sous-unité B de la toxine cholérique (CTB) ont été utilisés sur les cerveaux de rats témoins masculins et féminins et transgéniques (Tg) du VIH-1. Le rat HIV-1 Tg possède sept des neuf gènes qui composent le génome viral du VIH-1, ce qui conduit à un modèle non infectieux d’exposition à long terme à la protéine VIH-16,7,8. Des altérations dopaminergiques ont déjà été démontrées chez le rat Tg VIH-1, et le VIH-1 lui-même est une maladie inflammatoire, de sorte que le choix de l’anticorps était pertinent pour le plan expérimental9,10,11,12. CTB est un traceur qui se fixe aux neurones via la liaison ganglioside et peut être utilisé pour tracer les projections afférentes dans le cerveau. CTB a déjà été utilisé pour étudier les projections du noyau accumbens à la zone substantia nigra, deux zones du cerveau fortement impliquées dans les voies dopaminergiques13,14,15.
Dans ce protocole, TH servira de marqueur pour la production de dopamine, et Iba1 marquera la microglie activée. L’anticorps TH utilisé marque sélectivement une seule bande à environ 62 kDa qui correspond à la tyrosine hydroxylase. L’anticorps Iba1 correspond à la séquence carboxy-terminale Iba1. Les deux anticorps ont été élevés chez le lapin et étaient polyclonaux. Le CTB sera utilisé pour le traçage rétrograde des neurones de la zone du noyau accumbens à la zone de la substantia nigra. Le protocole actuel offre également une ligne directrice pour l’ajustement du protocole iDISCO original de deux manières distinctes: 1) réduction globale de la coloration de fond en modifiant les réactifs sériques dans les étapes de blocage, et 2) mise à l’échelle du temps d’incubation pour convenir à des échantillons de tissus plus importants. Dans l’ensemble, le présent protocole fournit des preuves continues que les techniques de clairage hydrophobe sont réalisables dans les tissus cérébraux du rat, n’ont aucune interaction néfaste perceptible avec les protéines virales du VIH-1 et sont compatibles avec les anticorps TH, les anticorps Iba1 et le CTB.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41121-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 primary antibody</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-sil epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1l-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td>mini pump variable flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

Les méthodes de nettoyage des tissus hydrophobes sont des procédures facilement ajustables, rapides et peu coûteuses qui permettent l’étude d’une molécule d’intérêt dans des échantillons de tissus non inaltérables. Les procédures traditionnelles d’immunomarquage nécessitent de couper l’échantillon en sections minces, ce qui limite la capacité d’étiqueter et d’examiner les structures intactes. Cependant, si le tissu cérébral peut rester intact pendant le traitement, les structures et les circuits peuvent rester intacts pour l’analyse. Les méthodes de nettoyage précédemment établies prennent beaucoup de temps pour nettoyer complètement le tissu, et les produits chimiques agressifs peuvent souvent endommager les anticorps sensibles. La méthode iDISCO élimine rapidement et complètement les tissus, est compatible avec de nombreux anticorps et ne nécessite aucun équipement de laboratoire spécial. Cette technique a été initialement validée pour l’utilisation dans les tissus de souris, mais le protocole actuel adapte cette méthode à l’imagerie des hémisphères de contrôle et des cerveaux de rats transgéniques. En plus de cela, le protocole actuel apporte également plusieurs ajustements au protocole préexistant pour fournir des images plus claires avec moins de taches d’arrière-plan. Les anticorps dirigés contre l’Iba-1 et la tyrosine hydroxylase ont été validés chez le rat transgénique VIH-1 et chez les rats témoins F344/N en utilisant la méthode actuelle de nettoyage des tissus hydrophobes. Le cerveau est un réseau entrelacé, où les structures travaillent ensemble plus souvent que séparément les unes des autres. L’analyse du cerveau en tant que système entier par opposition à une combinaison de pièces individuelles est le plus grand avantage de cette méthode d’éclaircissement du cerveau entier.

L’élimination complète de grandes sections de tissu cérébral de rat F344/N et VIH-1 a été réalisée à l’aide de ce protocole modifié de nettoyage des tissus hydrophobes. La figure 1 montre une image confocale typique de TH dans la région de substantia nigra. La figure 1A représente une coloration dense et positive. Les zones denses comme celles-ci peuvent être analysées en se concentrant à travers le plan « Z » pour confirmer une coloration...

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Nous présentons ici une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes qui permet de visualiser les molécules cibles dans le cadre de structures cérébrales intactes. Cette technique a maintenant été validée pour les rats transgéniques F344/N et le VIH-1 des deux sexes.

Une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes pour le tissu cérébral de rat

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K vues.  University of South Carolina. Nous présentons ici une méthode de nettoyage des tissus hydrophobes qui permet de visualiser les molécules cibles dans le cadre de structures cérébrales intactes. Cette technique a maintenant été validée pour les rats transgéniques F344/N et le VIH-1 des deux sexes.

Vidéo: A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Préparation du tissu cérébral de souris pour microscopie électronique

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Recherche

Neurosciences

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Immunoprécipitation de la chromatine du tissu racinaire ganglions dorsaux suivants lésions axonales

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Intact Caractérisation histologique du cerveau Microdevices-implantées et les tissus environnants

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Analyse immunohistochimique dans le système nerveux central et périphérique Rat ganglionnaire sections de tissu

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primaire pour Immunohistochimie sur tissus Cryosectioned cerveau de rat: Exemple coloration pour microglies et les neurones

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Un modèle de Rat de doux Hypoperfusion intra-utérine avec sténose de le Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Roman passif méthodes de compensation pour la Production rapide de transparence optique dans tout le tissu CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Préparation du tissu cérébral nouveau-né du rat pour l’analyse morphométrique ultrastructurale de la distribution synaptique des vésicules aux terminaux nerveux