Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse finanziert: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & durch T32 Training Grant 5T32GM081740

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of South Carolina überprüft und genehmigt.
1. Vorbereitung der Lagerlösung
<ol><li>Lösung 1 (1 L): Zu 900 ml entionisiertemH2Owerden 100 mL 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 2 ml Triton X-100 hinzugefügt.</li>
	<li>Lösung 2 (1 L): Zu 900 ml entionisiertemH2Owerden 100 ml 10x PBS, 2 ml Tween-20 und 1 ml 10 mg/ml Heparin-Stammlösung hinzugefügt.</li>
	<li>Lösung 3 (500 ml): Zu 400 ml Lösung 11,5 g Glycin und 100 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) hinzufügen.</li>
	<li>Lösung 4 (50 ml): Zu 42 ml Lösung 1 werden 3 ml entsprechendes Serum und 5 ml DMSO hinzugefügt.</li>
	<li>Primäre Antikörperlösung (50 ml): Zu 46 ml Lösung 2 werden 2,5 ml DMSO und 1,5 ml entsprechendes Serum hinzugefügt.</li>
	<li>Sekundäre Antikörperlösung (50 ml): Zu 48,5 ml Lösung 2 werden 1,5 ml entsprechendes Serum hinzugefügt. HINWEIS: Verwenden Sie für Lösung 4, Primärlösung und Sekundärlösung ein Serum, das dem sekundären Antikörper (z. B. Ziege, Pferd, Rind) entspricht.</li>
</ol>2. Probenvorbereitung
HINWEIS: Führen Sie die Schritte 2.1 bis 2.7 in einem Abzug aus, um die Exposition gegenüber PFA zu begrenzen.
<ol><li>Junge (3-6 Wochen) Ratten mit Sevofluran tief betäuben; Fahren Sie mit 2.2 fort, wenn die Ratte nicht anspricht und nicht auf Zehen- und Schwanzklemmen reagiert.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte in Rückenlage und machen Sie mit einer Irisschere einen Schnitt durch die Bauchdecke.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Mayo-Schere durch den Boden des Brustkorbs bis zum Schlüsselbein auf beiden Seiten des Brustkorbs.</li>
	<li>Befestigen Sie das Brustbein und die Rippen weg vom Herzen und der Lunge mit einem Hämostat.</li>
	<li>Durchbohren Sie den linken Ventrikel mit einer 23 G Nadel, die an einer Perfusionspumpe befestigt ist, und schneiden Sie den rechten Vorhof mit einer Irisschere.</li>
	<li>Führen Sie eine transkardiale Perfusion mit ca. 75 ml 100 mM (1x) PBS durch.</li>
	<li>Setzen Sie die transkardiale Perfusion mit etwa 100 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) fort, das in 1x PBS gepuffert ist.</li>
	<li>Entfernen Sie das Gehirn mit einer Pinzette vom Schädel.</li>
	<li>Legen Sie das Gehirn in sagittale Position und schneiden Sie es mit einer Rasierklinge und einer Rattenhirnmatrix in 4 gleiche Abschnitte (ca. 3 mm breit).</li>
	<li>Fixieren Sie jeden Abschnitt in 4% PFA in 1x PBS in einem versiegelten, 5mL Kunststoffrohr über Nacht bei 4 °C auf einem Shaker.</li>
	<li>Fixieren Sie weiterhin 4% PFA in 1x PBS bei Raumtemperatur (RT) auf einem Shaker für 1 h.</li>
	<li>Waschen Sie jeden Abschnitt mit 1x PBS bei RT für 30 min, 3 mal.</li>
</ol>3. Dehydrierung und Depigmentierung
<ol><li>Inkubieren Sie die Probe in einer 20% igen Methanol/ 80% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 40% Methanol / 60% entionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 60% Methanol / 40% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 80% Methanol / 20% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in 100% Methanol für 1 h bei RT. Wiederholen Sie mit mehr 100% Methanol und inkubieren Sie für 1 h bei RT.</li>
	<li>Kühlen Sie die Probe in 100% Methanol bei 4° C für ca. 10 min.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 66% ige Dichlormethan (DCM)/33% ige Methanollösung vor.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe über Nacht in der DCM/Methanol-Lösung bei RT unter Schütteln.</li>
	<li>Mit Methanol bei RT 30 min, 2 mal waschen.</li>
	<li>Kühlen Sie die Probe in 100% Methanol bei 4° C für ca. 10 min.</li>
	<li>Bleiche in gekühltem, frisch zubereitetem 5% Wasserstoffperoxid in Methanol über Nacht bei 4° C.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 80% Methanol / 20% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 60% Methanol / 40% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 40% Methanol / 60% entionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 20% igen Methanol/ 80% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in 1x PBS für 1 h bei RT.</li>
	<li>In Lösung 1 für 1 h bei RT 2 mal waschen.</li>
</ol>4. Choleratoxin-Untereinheit B-Kennzeichnung
<ol><li>Führen Sie die Nadelspitze der 1 ml Spritze in die Nucleus accumbens-Stelle ein.</li>
	<li>Langsam 2,5 μL 1% Biotin-CTB über 20 s injizieren.</li>
	<li>Lassen Sie die Nadelspitze für 1 Minute an Ort und Stelle und entfernen Sie langsam über 10 s, um ein Auslaufen zu vermeiden.</li>
</ol>5. Antikörper-Anwendung
<ol><li>Die Probe in Lösung 3 für 2 Tage bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.</li>
	<li>Die Probe in Lösung 4 für 2 Tage bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.</li>
	<li>Mit primärem Antikörper 7 Tage bei 37 °C in einem Wasserbad inkubieren.</li>
	<li>In Lösung 2 5 mal waschen und 1 h pro Waschgang inkubieren. Speichern Sie lösungsweise in Lösung 2 bei RT.</li>
	<li>Mit sekundären Antikörpern 7 Tage bei 37 °C im Wasserbad inkubieren.</li>
	<li>In Lösung 2 5 Mal waschen und 1 h pro Waschgang inkubieren; über Nacht in Lösung 2 bei RT speichern. HINWEIS: Alle Schritte ab 5.6, einschließlich der Endlagerung, sollten bei schlechten Lichtverhältnissen erfolgen. Die Probenröhrchen können mit Aluminiumfolie abgeschirmt werden. Die für die Antikörper in diesem Protokoll verwendeten Konzentrationen waren: TH bei 1:100, Iba1 bei 1:200 und der sekundäre Antikörper bei 1:100. Fügen Sie den Schritten 5.1-5.6 zusätzliche Lösung 2 hinzu, um sicherzustellen, dass die Röhrchen vollständig gefüllt sind.</li>
</ol>6. Gewebereinigung
<ol><li>Inkubieren Sie die Probe in einer 20% igen Methanol/ 80% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 40% Methanol / 60% entionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 60% Methanol / 40% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in einer 80% Methanol / 20% deionisierten Wasserlösung für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Probe in 100% Methanol für 1 h bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie in frischem 100% Methanol über Nacht bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie in 66% DCM / 33% Methanol für 3 h, mit Schütteln, bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie dibenzylether (DBE) ohne zu schütteln. Lassen Sie das Beispiel in DBE, bis es klar ist, und speichern Sie es in DBE bis zur Bildgebung.</li>
</ol>7. Montage
<ol><li>Erhalten Sie eine 3D-gedruckte Kammer aus Visijet M3 Crystal Harz (Vorlagen auf der idisco.info Website verfügbar).</li>
	<li>Befestigen Sie die Kammer mit einem Epoxidharz an einem Objektträger.</li>
	<li>Platzieren Sie die Probe in dem quadratischen Raum in der Mitte der Kammer.</li>
	<li>Füllen Sie die Kammer vollständig mit DBE.</li>
	<li>Legen Sie einen 0,17 mm dicken Abdeckrlip über die Kammer und drücken Sie Druck aus, bis der Abdeckripp vollen Kontakt mit den Kammerwänden hat.</li>
	<li>Versiegeln Sie die Kanten des Abdecklippes mit dem Epoxidharz zur Kammer.</li>
	<li>Drehen Sie die Kammer, damit Luftblasen aus dem Fülleinlass entweichen können.</li>
	<li>Füllen Sie die Kammer mit zusätzlichem DBE.</li>
	<li>Den Fülleinlass mit Epoxidharz verschließen und aushärten lassen. HINWEIS: Überschüssiges DBE wird während der Montage auslaufen.</li>
</ol>8. Bildgebung
<ol><li>Verwenden Sie ein konfokales Mikroskopsystem, um einen Z-Scan mit 4-facher Vergrößerung durchzuführen (siehe das beigefügte 3D-Video).</li>
	<li>Erreichen Sie eine fluoreszierende Anregung der Probe mit einem Lasersatz, der bei einer Wellenlänge emittiert, die der vom sekundären Antikörper angegebenen Wellenlänge ähnelt. Die TH-Anregung wurde mit einem HeNe-Lasersatz erreicht, der bei 632 nm emittiert.</li>
	<li>Stellen Sie den Detektor auf eine Wellenlänge in der Nähe der Laseremission ein. Für das vorliegende Protokoll wurde der Detektor für TH auf 650 nm eingestellt.</li>
	<li>Erhöhen Sie die Verstärkung des Detektors, bis ein sichtbares Signal vorhanden ist. Die Verstärkung von 650LP für Bilder wurde auf 7,50 B eingestellt.</li>
	<li>Bewegen Sie mit der Scan-Option in der konfokalen Bildgebungssoftware den Mikroskopstand, bis die Probe in den Fokus gehoben wird.</li>
	<li>Navigieren Sie in allen Ebenen durch das Gewebe und erhalten Sie entweder Einzelbilder oder Z-Stack-Bilder mit der konfokalen Bildgebungssoftware.</li>
	<li>Sobald die Bildgebung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Probe aus der Kammer. Legen Sie es wieder in ein vollständig mit DBE gefülltes Rohr und lagern Sie es bei RT an einem dunklen Ort, vorzugsweise mit Aluminiumfolie bedeckt. HINWEIS: Proben können wieder montiert und abgebildet werden, solange das Blütenstandssignal noch stark ist.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte zu erklären.

Tissue Clearing bietet eine Lösung für die Einschränkungen des traditionellen IHC-Protokolls. Eine transparente Probe minimiert die Streuung und Absorption von Licht, was auf zellulärer Ebene einen optischen Zugang zu intaktem Gewebebietet 18,19. Gewebereinigungstechniken machen ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung mit der Verabreichung von Lösungsmitteln transparent. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gew...

Mehrere Gewebereinigungstechniken wurden für den Einsatz im Gehirn validiert: Hydrogel, hydrophil und hydrophob. Diese Techniken zielen darauf ab, ein Gewebe durch Entgiftung, Entfärbung und Entkalkung durch die Verabreichung von Lösungsmitteln transparent zu machen. Sobald der Brechungsindex der Gewebeprobe mit dem Brechungsindex des gewählten Bildgebungsmediums übereinstimmt, kann ein klares Bild der Probe erhalten werden. Hydrogel-basierte Techniken wie CLARITY sichern Biomoleküle im Gewebe, indem sie mit Hydrogelen auf Acrylbasis verbunden werden, was strukturelle Schäden und den Verlust von Proteinen verhindert1. Hydrogel-Techniken verwenden jedoch aggressive Chemikalien, die das Potenzial haben, zerbrechlichere Gewebe zu schädigen, und dichtere Gewebeproben sind möglicherweise nicht mit dem Hydrogel-Protokoll kompatibel. Bestimmte Hydrogeltechniken können teure Geräte erfordern oder zu einer Gewebeausdehnung führen. Hydrophile Techniken, wie CUBIC, bewahren die 3D-Struktur durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen im Gewebe2. Gewebeerweiterung kann auch in bestimmten hydrophilen Protokollen auftreten. Die Clearingfähigkeit hydrophiler Techniken entspricht oft nicht der Fähigkeit hydrophober Techniken, die für dichtere und dickere Gewebe wichtig ist3.
Hydrophobe Techniken sind in der Regel schnell, erfordern keine spezielle Ausrüstung und produzieren eine Probe, die einfach zu handhaben und zu lagern ist. iDISCO ist eine hydrophobe Technik, die die Schrumpfung beseitigt, die in anderen hydrophoben Protokollen auftreten kann. Ursprünglich wurde die iDISCO Gewebereinigungstechnik von Renier et al.4 für die Embryonen und dichten, adulten Organe von Mäusen beschrieben. Diese Technik entfernt dem Gewebe im ersten Austrocknungsschritt Wasser und reduziert so die Lichtstreuung. Gewebe wird während der Vorbehandlung permeabilisiert, um eine tiefe Antikörperpenetration zu ermöglichen. Alexa Fluor Farbstoffe im fernroten Spektrum werden zur Immunmarkierung verwendet, um autofluoreszenz des Gewebes bei niedrigeren Wellenlängen zu vermeiden5. Gewebe, das hydrophoben Clearing-Protokollen unterzogen wurde, kann leicht gehandhabt und aufgrund der Langlebigkeit der Alexa Fluor-Farbstoffe mehrmals abgebildet werden. Bei richtiger Lagerung können Gewebe nach der ersten Verarbeitung Monate bis zu einem Jahr lang Bilder liefern.
Im vorliegenden Protokoll wurden Tyrosinhydroxylase (TH) Antikörper, Iba1 Antikörper und Cholera Toxin Subunit B (CTB) sowohl bei männlichen und weiblichen Kontroll- als auch bei HIV-1 transgenen (Tg) Rattengehirnen eingesetzt. Die HIV-1 Tg-Ratte besitzt sieben der neun Gene, aus denen das HIV-1-Virusgenom besteht, was zu einem nicht-infektiösen Modell der langfristigen HIV-1-Proteinexposition führt6,7,8. Dopaminerge Veränderungen wurden zuvor bei der HIV-1 Tg-Ratte nachgewiesen, und HIV-1 selbst ist eine entzündliche Erkrankung, so dass die Antikörperwahl für das experimentelle Design relevant war9,10,11,12. CTB ist ein Tracer, der über Gangliosidbindung an Neuronen bindet und verwendet werden kann, um affelinete Projektionen im Gehirn zu verfolgen. CTB wurde zuvor verwendet, um Projektionen vom Nucleus accumbens bis zum Substantia nigra-Bereich zu untersuchen, zwei Bereichen des Gehirns, die stark an dopaminergen Signalwegen beteiligt sind13,14,15.
In diesem Protokoll wird TH als Marker für die Dopaminproduktion dienen, und Iba1 wird aktivierte Mikroglia markieren. Der verwendete TH-Antikörper kennzeichnet selektiv ein einzelnes Band bei etwa 62 kDa, das der Tyrosinhydroxylase entspricht. Der Iba1-Antikörper entspricht der Iba1-Carboxy-terminalen Sequenz. Beide Antikörper wurden bei Kaninchen aufgezogen und waren polyklonal. CTB wird zur retrograden Rückverfolgung von Neuronen vom Nucleus accumbens-Bereich bis zum Substantia nigra-Bereich verwendet. Das aktuelle Protokoll bietet auch eine Richtlinie für die Anpassung des ursprünglichen iDISCO-Protokolls auf zwei verschiedene Arten: 1) Gesamtreduktion der Hintergrundfärbung durch Änderung der Serumreagenzien in den Blockierungsschritten und 2) Skalierung der Inkubationszeit, um für größere Gewebeproben geeignet zu sein. Insgesamt liefert das vorliegende Protokoll weiterhin Beweise dafür, dass hydrophobe Clearing-Techniken im Gehirngewebe der Ratte durchführbar sind, keine erkennbaren schädlichen Wechselwirkungen mit HIV-1-Virusproteinen aufweisen und mit TH-Antikörpern, Iba1-Antikörpern und CTB kompatibel sind.

<table><tbody><tr><td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Chemical</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Life Science</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 primary antibody</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil epoxy</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1l-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion machine</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>mini pump variable flow</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH primary antibody</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

Hydrophobe Gewebereinigungsmethoden sind leicht einstellbare, schnelle und kostengünstige Verfahren, die die Untersuchung eines Moleküls von Interesse in unveränderten Gewebeproben ermöglichen. Herkömmliche Immunmarkierungsverfahren erfordern das Schneiden der Probe in dünne Abschnitte, was die Fähigkeit einschränkt, intakte Strukturen zu kennzeichnen und zu untersuchen. Wenn jedoch Hirngewebe während der Verarbeitung intakt bleiben kann, können Strukturen und Schaltkreise für die Analyse intakt bleiben. Zuvor etablierte Clearing-Methoden brauchen viel Zeit, um das Gewebe vollständig zu reinigen, und die aggressiven Chemikalien können oft empfindliche Antikörper schädigen. Die iDISCO-Methode räumt Gewebe schnell und vollständig, ist mit vielen Antikörpern kompatibel und erfordert keine spezielle Laborausrüstung. Diese Technik wurde ursprünglich für den Einsatz in Mäusegewebe validiert, aber das aktuelle Protokoll passt diese Methode an die Abbildung von Hemisphären von Kontroll- und transgenen Rattengehirnen an. Darüber hinaus nimmt das vorliegende Protokoll auch mehrere Anpassungen am bereits vorhandenen Protokoll vor, um klarere Bilder mit weniger Hintergrundflecken zu liefern. Antikörper gegen Iba-1 und Tyrosinhydroxylase wurden bei der transgenen HIV-1-Ratte und bei F344/N-Kontrollratten mit der vorliegenden hydrophoben Gewebereinigungsmethode validiert. Das Gehirn ist ein verwobenes Netzwerk, in dem Strukturen häufiger zusammenarbeiten als getrennt voneinander. Die Analyse des Gehirns als Gesamtsystem im Gegensatz zu einer Kombination einzelner Teile ist der größte Vorteil dieser gesamten Gehirnreinigungsmethode.

Die vollständige Beseitigung großer Abschnitte von F344/N- und HIV-1-Rattenhirngewebe wurde mit diesem modifizierten hydrophoben Gewebereinigungsprotokoll erreicht. Abbildung 1 zeigt ein typisches konfokales Bild für TH im Bereich substantia nigra. Abbildung 1A stellt eine dichte, positive Färbung dar. Dichte Bereiche wie diese können durch Fokussierung durch die "Z" -Ebene analysiert werden, um eine positive Färbung und die richtige Zellmorphologie zu bes...

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A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hier stellen wir eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode vor, die es ermöglicht, Zielmoleküle als Teil intakter Gehirnstrukturen zu betrachten. Diese Technik wurde nun für die F344/N-Kontrolle und HIV-1 transgene Ratten beiderlei Geschlechts validiert.

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K Aufrufe.  University of South Carolina. Hier stellen wir eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode vor, die es ermöglicht, Zielmoleküle als Teil intakter Gehirnstrukturen zu betrachten. Diese Technik wurde nun für die F344/N-Kontrolle und HIV-1 transgene Ratten beiderlei Geschlechts validiert.

Serie: A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2-Gefäßverschluss / Hypotonie: Eine Ratte Modell der globalen Hirnischämie

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

Forschung

Medizin

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

Metabolische Unterstützung der herausgeschnitten, lebendes Gehirn Gewebe während der Magnet-Resonanz-Mikroskopie-Akquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

Biotechnik

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Sublimation von DAN Matrix für die Erkennung und Visualisierung von Gangliosiden in Rattenhirngewebe für die MALDI-Imaging-Massenspektrometrie

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

Neurowissenschaften

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

Ein Mikro-CT-basierte Verfahren zur Charakterisierung von Läsionen und Lokalisierung von Elektroden in kleinen tierischen Gehirnen

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred microliters of autologous blood was taken from the tail vein and stereotaxically injected into the pons. The injection process was divided into 2 steps: First, 10 &#181;L of blood was injected into a specific location, anteroposterior position (AP) -9.0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9.2 mm, followed by a second injection of the residual blood located at AP -9.0 mm; Lat 0 mm; Vert -9.0 mm with a 20-minute interval. The balance beam test, limb placement test, and the modified Voestch neuroscore were used to evaluate neurological function. Magnetic Resonance Imaging (MRI) was used to assess the volume of hemorrhage in vivo. The symptoms of this model were in line with patients with massive pontine hemorrhage.

We present a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat via dual injection of autologous blood.

Massive Pontinenblutung durch Doppelinjektion von Eigenblut

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

Bildgebung und Quantifizierung intakter neuronaler Dendriten mittels CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

Untersuchung der räumlichen Interaktion zwischen Astrozyten und Neuronen in geräumten Gehirnen

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Extraction and Tissue Clearing Preparation of Mouse Brain-Spinal Cord Samples

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, neuronal connectivity, and molecular dynamics. Traditional methodologies for investigating the entire brain and spinal cord often involve isolating, sectioning, and scanning tissue slices, followed by the labor-intensive process of three-dimensional image reconstruction. This conventional approach can be both time-consuming and cumbersome. Advancements in tissue clearing and whole-organ imaging techniques have revolutionized the analysis of the entire brain and spinal cord. To maximize the potential of these innovative methods, it is essential to extract and clear brain samples while maintaining their connection to the spinal cord. This protocol provides a detailed and systematic guide for preparing samples of the brain connected to the spinal cord, outlining the extraction and clearing procedures. By streamlining these processes, this approach significantly enhances experimental efficiency and data integrity, thereby fostering advancements in neuroscience research and enabling more comprehensive investigations into the complexities of the central nervous system.

This study presents a protocol for extracting and preparing cleared whole-brain and spinal cord samples with preserved fluorescent signals, enhancing experimental efficiency and data integrity to advance neuroscience research.

Extraktion und Gewebereinigung Aufbereitung von Proben aus dem Gehirn und dem Rückenmark der Maus

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for a Rat Brain Tissue Sample

<a href='https://app.jove.com/v/61821/a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue'>Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).</a>This video demonstrates the method of hydrophobic tissue clearing of a rat brain tissue sample. The sample is sequentially dehydrated in methanol, treated with a dichloromethane and methanol mixture to dissolve lipids and pigments, and transferred to dibenzyl ether for complete tissue clearing, enabling detailed imaging without thin sectioning.

Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).This video demonstrates the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

Eine Methode zur Isolierung neurovaskulärer Einheiten aus dem Gehirn von Ratten

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...