Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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この作品はNIH助成金によって資金提供されました: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & T32トレーニンググラント5T32GM081740によって

すべての動物のプロトコルは、サウスカロライナ大学の動物ケアと使用委員会によって見直され、承認されました。
1. ストックソリューションの準備
<ol><li>溶液1(1 L):900mLの脱イオン化H2Oは、100mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と2mLのトリトンX-100を加える。</li>
	<li>溶液2(1 L):脱イオン化H2Oの900mLに、10x PBSの100mL、Tween-20の2mL、10mg/mLヘパリンストック溶液の1mLを加える。</li>
	<li>溶液3(500mL):溶液1の400mLに、グリシン11.5gとジメチルスルホキシド(DMSO)100mLを加える。</li>
	<li>溶液4(50mL):溶液1の42mLに、対応する血清3 mLとDMSOの5 mLを加える。</li>
	<li>一次抗体溶液(50 mL):溶液2の46mLに、DMSOの2.5mLおよび1.5mLの対応する血清を加える。</li>
	<li>二次抗体溶液(50 mL):溶液2の48.5mLに、対応する血清1.5mLを加える。 注:溶液4、一次溶液、および二次溶液については、二次抗体(例えば、ヤギ、馬、ウシ)に対応する血清を使用してください。</li>
</ol>2. サンプル準備
注:PFAへの露出を制限するため、ヒュームフードでステップ2.1〜2.7を実行してください。
<ol><li>セボフルランを使用して若い(3-6週間)ラットを深く麻酔します。ラットが応答せず、つま先と尾のピンチに応答しない場合は2.2に進みます。</li>
	<li>ラットを仰向けの位置に置き、アイリスはさみを使用して腹壁を切開します。</li>
	<li>マヨはさみを使用して、リブケージの両側の鎖骨にリブケージの底を切り抜きます。</li>
	<li>胸骨と肋骨を心臓と肺から離し、止まり止めをします。</li>
	<li>灌流ポンプに取り付けられた23G針で左心室を突き刺し、アイリスハサミで右心房を切ります。</li>
	<li>約75mLの100mM(1x)PBSで経心面灌流を行います。</li>
	<li>1x PBSで約100mLのパラホルムアルデヒド(PFA)緩衝を行い、経心透交を続けます。</li>
	<li>鉗子を使用して頭蓋骨から脳を取り除く。</li>
	<li>脳を矢状位置に置き、カミソリの刃とラットの脳マトリックスを使用して4等分(幅約3mm)にスライスします。</li>
	<li>各セクションを1x PBSで4%PFAで密閉し、5mLプラスチックチューブを4°Cで一晩シェーカーで固定します。</li>
	<li>シェーカー上で1時間、室温(RT)で1x PBSで4%PFAで1時間固定を続けます。</li>
	<li>RTで各セクションを1x PBSで30分間3回洗浄します。</li>
</ol>3. 脱水・脱色
<ol><li>試料を20%メタノール/80%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。</li>
	<li>サンプルを40%メタノール/60%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間行います。</li>
	<li>サンプルを60%メタノール/40%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。</li>
	<li>サンプルを80%メタノール/20%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間培養します。</li>
	<li>RTで100%メタノールで100%メタノールでサンプルをインキュベートし、100%メタノール以上で繰り返し、RTで1時間インキュベートする。</li>
	<li>サンプルを4°Cで100%メタノールで約10分間冷やします。</li>
	<li>66%ジクロロメタン(DCM)/33%メタノール溶液を調製します。</li>
	<li>サンプルをDCM/メタノール溶液に一晩RTでインキュベートし、振盪します。</li>
	<li>RTでメタノールを30分、2回洗浄します。</li>
	<li>サンプルを4°Cで100%メタノールで約10分間冷やします。</li>
	<li>冷蔵し、4°Cで一晩メタノール中に5%過酸化水素を調製した漂白剤。</li>
	<li>サンプルを80%メタノール/20%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間培養します。</li>
	<li>サンプルを60%メタノール/40%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。</li>
	<li>サンプルを40%メタノール/60%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間行います。</li>
	<li>試料を20%メタノール/80%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。</li>
	<li>サンプルを1x PBSで1時間RTでインキュベートする。</li>
	<li>溶液1をRTで1時間、2回洗浄する。</li>
</ol>4. コレラ毒素サブユニットBラベル
<ol><li>1 mL シリンジの針先を、直腸核部位に挿入します。</li>
	<li>20秒以上の1%ビオチン-CTBの2.5 μLをゆっくりと注入する。</li>
	<li>針先を1分間所定の位置に置き、漏れを防ぐために10s以上ゆっくりと取り外します。</li>
</ol>5. 抗体アプリケーション
<ol><li>溶液3のサンプルを水浴中の37°Cで2日間インキュベートする。</li>
	<li>溶液4のサンプルを水浴中の37°Cで2日間インキュベートする。</li>
	<li>一次抗体を水浴中の37°Cで7日間インキュベートする。</li>
	<li>溶液2で5回洗浄し、1回の洗浄につき1時間インキュベートする。一晩RTでソリューション2に保存します。</li>
	<li>二次抗体を水浴中の37°Cで7日間インキュベートする。</li>
	<li>溶液2で5回洗浄し、1回の洗浄につき1時間のインキュベート。一晩RTでソリューション2に保管してください。 注: 5.6 以降のすべてのステップ (最終ストレージを含む) は、低照度で行う必要があります。サンプル管はアルミニウムホイルによって保護することができる。このプロトコルで抗体に使用された濃度は、TH 1:100、Iba1 1:200、2次抗体1:100でした。手順 5.1 ~ 5.6 にソリューション 2 を追加して、チューブが完全に充填されるようにします。</li>
</ol>6. 組織のクリアリング
<ol><li>試料を20%メタノール/80%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。</li>
	<li>サンプルを40%メタノール/60%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間行います。</li>
	<li>サンプルを60%メタノール/40%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間たたきます。</li>
	<li>サンプルを80%メタノール/20%脱イオン水溶液にインキュベートし、RTで1時間培養します。</li>
	<li>試料を100%メタノールで1時間RTでインキュベートする。</li>
	<li>RTで一晩新鮮な100%メタノールでインキュベート。</li>
	<li>66%DCM/33%メタノールで3時間、振動しながら室温でインキュベートする。</li>
	<li>ジベンジルエーテル(DBE)を振らずにインキュベートする。透明になるまでサンプルを DBE に残し、イメージングまで DBE に保存します。</li>
</ol>7. 取り付け
<ol><li>Visijet M3クリスタル樹脂(idisco.info のウェブサイトで入手可能なテンプレート)で作られた3Dプリントチャンバーを入手してください。</li>
	<li>エポキシを使用して顕微鏡スライドにチャンバーを固定します。</li>
	<li>チャンバーの中央にある正方形のスペースにサンプルを置きます。</li>
	<li>チャンバーをDBEで完全に充填します。</li>
	<li>厚さ0.17mmのカバースリップをチャンバーの上に置き、カバースリップがチャンバーの壁に完全に接触するまで圧力を加えます。</li>
	<li>エポキシを使用して、カバースリップの端をチャンバーに密封します。</li>
	<li>チャンバーを回転させて、気泡が充填入口から抜け出せるようにします。</li>
	<li>追加のDBEでチャンバーを充填します。</li>
	<li>充填インレットをエポキシで密封し、治癒を許可します。 メモ:マウント中に余分なDBEがこぼれます。</li>
</ol>8. イメージング
<ol><li>共焦点顕微鏡システムを使用して、4倍の倍率でZスキャンを実行します(付属の 3Dビデオを参照)。</li>
	<li>二次抗体で指定された波長と同様の波長で発光するレーザーセットを用いて、試料の蛍光励起を実現します。TH励起は、632nmで発光するように設定されたHeNeレーザーを利用して達成された。</li>
	<li>検出器をレーザー放射に近い波長に設定します。本プロトコルについては、THの検出器を650nmに設定した。</li>
	<li>目に見える信号が出るまで検出器のゲインを上げます。画像の650LPゲインは7.50 Bに設定されました。</li>
	<li>共焦点イメージングソフトウェアの スキャン オプションを使用して、サンプルが焦点になるまで顕微鏡のステージを移動します。</li>
	<li>すべての平野の組織を移動し、共焦点イメージングソフトウェアを使用して単一の画像またはZスタック画像を取得します。</li>
	<li>イメージングが完了したら、チャンバーからサンプルを取り出します。DBEで完全に充填されたチューブに戻し、RTで暗い場所に保管し、好ましくはアルミホイルで覆います。 注: サンプルは、蛍光信号が依然として強い場合に限り、再マウントおよびイメージ化できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

著者の誰も宣言する利害の対立を持っていません。

組織のクリアリングは、従来のIHCプロトコルの限界に対するソリューションを提供します。透明な試料は、光の散乱および吸収を最小限に抑え、無傷の組織18,19への細胞レベルの光学的アクセスを提供する。組織クリア技術は、脱脂、脱色、および溶媒の投与による脱灰によって組織を透明にする。組織試料の屈折率が選択した撮像媒体の屈折率と...

いくつかの組織クリアリング技術は、脳内での使用のために検証されている:ヒドロゲル、親水性、および疎水性。これらの技術は、溶媒の投与を介して脱脂、脱色、および脱灰を通じて組織を透明にすることを目指しています。組織試料の屈折率が選択した撮像媒体の屈折率と一致すると、サンプルの鮮明な画像が得られる。CLARITYなどのヒドロゲルベースの技術は、それらをアクリルベースのヒドロゲルにリンクすることによって組織中の生体分子を固定し、タンパク質の構造的損傷および損失を防ぐ。しかし、ヒドロゲル技術は、より脆弱な組織を損傷する可能性を持つよりも過酷な化学物質を利用し、より密度の高い組織サンプルはヒドロゲルプロトコルと互換性がない可能性があります。ある種のヒドロゲル技術は、高価な機器を必要とするか、組織の膨張につながる可能性があります。親水性の技術は、CUBICのような、組織内の水素結合の形成を通じて3D構造を保存する2。組織の膨張はまた、特定の親水性プロトコルで起こり得る。親水性技術のクリア能は、疎水性技術が有する能力と一致しないことが多く、これはより密度が高く、より厚い組織3にとって重要である。
疎水性の技術は、通常、高速で、特別な機器を必要とせず、取り扱い、保管が容易なサンプルを製造します。iDISCOは、他の疎水性プロトコルで起こり得る収縮を排除する疎水性技術です。もともと、iDISCO組織除去技術は、マウスの胚および緻密な成人器官に対するRenier et4 によって記述された。この技術は、初期脱水工程で組織から水分を除去し、光散乱を低減させる。組織は、深い抗体の浸透を可能にするために、前処理中に透過化されます。遠赤色スペクトルのアレクサ蛍光色素は、低波長5で組織の自己蛍光を避けるために免疫標識に使用される。疎水性のクリアリングプロトコルを受けた組織は容易に扱うことができる、Alexa Fluor染料の長寿のために数回イメージすることができる。適切に保存されていれば、組織は初期処理後数ヶ月から1年の画像を提供することができます。
本プロトコルにおいて、チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体、Iba1抗体、およびコレラ毒素サブユニットB(CTB)は、男性および女性の両方のコントロールおよびHIV-1トランスジェニック(Tg)ラット脳に使用された。HIV-1 Tgラットは、HIV-1ウイルスゲノムを構成する9つの遺伝子のうち7個を有し、これは長期HIV-1タンパク質暴露6、7、8の非感染モデルをもたらす。ドーパミン作動性変化は、HIV-1 Tgラットで以前に実証されており、HIV-1自体は炎症性疾患であるため、抗体選択は実験計画9、10、11、12に関連していた。CTBは、神経節側結合を介してニューロンに付着し、脳内の発泡性突起を追跡するために使用することができるトレーサーです。CTBは以前、副坐核から実質的なニグラ領域への突起を研究するために使用されてきたが、ドーパミン作動経路13、14、15に深く関与する脳の2つの領域。
このプロトコルでは、THはドーパミン産生のマーカーとして機能し、Iba1は活性化ミクログリアをマークします。TH抗体は、チロシンヒドロキシラーゼに対応する約62kDaで単一のバンドを選択的に標識します。Iba1抗体は、Iba1カルボキシ末端配列に対応します。両方の抗体はウサギで育てられ、ポリクローナルであった。CTBは、核accumbens領域から実質的なニグラ領域へのニューロンの逆行トレースに使用されます。現在のプロトコルはまた、2つの異なる方法で元のiDISCOプロトコルの調整のためのガイドラインを提供しています:1)ブロッキングステップで血清試薬を変更することによってバックグラウンド染色の全体的な減少、および2)より大きな組織サンプルに適したインキュベーション時間のスケーリング。全体として、本プロトコルは、疎水性除去技術がラットの脳組織において実現可能であり、HIV-1ウイルスタンパク質との識別可能な有害相互作用を有せず、TH抗体、Iba1抗体およびCTBと互換性があるという継続的な証拠を提供する。

<table><tbody><tr><td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Chemical</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Life Science</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 primary antibody</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil epoxy</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1l-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion machine</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>mini pump variable flow</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH primary antibody</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

疎水性組織のクリアリング方法は、容易に調整可能で、速く、そして、不変の組織サンプルの目的の分子の研究を可能にする低コストのプロシージャである。従来の免疫標識法では、サンプルを薄い部分に切断する必要があり、無傷の構造にラベルを付け、検査する能力が制限されます。しかし、処理中に脳組織がそのまま残る場合、構造や回路は解析のためにそのまま残ることができます。以前に確立された清算方法は、組織を完全にクリアするのにかなりの時間がかかり、過酷な化学物質はしばしば敏感な抗体を損傷する可能性があります。iDISCO法は、組織を迅速かつ完全にクリアし、多くの抗体と互換性があり、特別なラボ機器を必要としません。この技術は、マウス組織での使用のために最初に検証されたが、現在のプロトコルは、制御およびトランスジェニックラット脳の半球を画像化するためにこの方法を適応させる。これに加えて、本プロトコルは、より少ない背景染色でより鮮明な画像を提供するために、既存のプロトコルにいくつかの調整を行います。Iba-1およびチロシンヒドロキシラーゼに対する抗体は、本疎水性組織除去法を用いてHIV-1トランスジェニックラット及びF344/N対照ラットで検証された。脳は、構造が互いに別々よりも頻繁に一緒に働く織り交ぜられたネットワークです。個々の部分の組み合わせとは対照的に、システム全体として脳を分析することは、この脳全体のクリアリング方法の最大の利点です。

F344/NおよびHIV-1ラットの両方の脳組織の大きなセクションの完全なクリアは、この修飾された疎水性組織クリアリングプロトコルを使用して達成された。 図1 は、立証ニグラ領域におけるTHの典型的な共焦点像を示す。 図1Aは 、密な正の染色を示す。このような密集した領域は、正の染色と適切な細胞形態を確認するために「Z」平面を通して焦点?...

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A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

ここでは、インタクトな脳構造の一部として標的分子を観察することを可能にする疎水性組織クリアリング法を提示する。この技術は現在、両方の男女のF344/ NコントロールおよびHIV-1トランスジェニックラットについて検証されている。

ラット脳組織の疎水性組織除去法

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K ビュー.  University of South Carolina. ここでは、インタクトな脳構造の一部として標的分子を観察することを可能にする疎水性組織クリアリング法を提示する。この技術は現在、両方の男女のF344/ NコントロールおよびHIV-1トランスジェニックラットについて検証されている。

ビデオ: A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2血管閉塞/低血圧：グローバル脳虚血のラットモデル

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

医学

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

代謝サポートの切除、生体脳磁気共鳴顕微鏡集録時に

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

生物工学

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

MALDIイメージングマススペクトロメトリーのためのラット脳組織におけるガングリオシドの検出と可視化のためのDANマトリックスの昇華

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

神経科学

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

マイクロ ct 画像に基づく法病変を特徴と、小動物の脳に電極を配置

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred microliters of autologous blood was taken from the tail vein and stereotaxically injected into the pons. The injection process was divided into 2 steps: First, 10 &#181;L of blood was injected into a specific location, anteroposterior position (AP) -9.0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9.2 mm, followed by a second injection of the residual blood located at AP -9.0 mm; Lat 0 mm; Vert -9.0 mm with a 20-minute interval. The balance beam test, limb placement test, and the modified Voestch neuroscore were used to evaluate neurological function. Magnetic Resonance Imaging (MRI) was used to assess the volume of hemorrhage in vivo. The symptoms of this model were in line with patients with massive pontine hemorrhage.

We present a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat via dual injection of autologous blood.

自家血液の二重注射による巨大なポンチン出血

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

CLARITY組織クリアリングによるインタクトニューロンデンドライトのイメージングと定量化

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

クリア脳におけるアストロサイトとニューロンの空間的相互作用の解明

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Extraction and Tissue Clearing Preparation of Mouse Brain-Spinal Cord Samples

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, neuronal connectivity, and molecular dynamics. Traditional methodologies for investigating the entire brain and spinal cord often involve isolating, sectioning, and scanning tissue slices, followed by the labor-intensive process of three-dimensional image reconstruction. This conventional approach can be both time-consuming and cumbersome. Advancements in tissue clearing and whole-organ imaging techniques have revolutionized the analysis of the entire brain and spinal cord. To maximize the potential of these innovative methods, it is essential to extract and clear brain samples while maintaining their connection to the spinal cord. This protocol provides a detailed and systematic guide for preparing samples of the brain connected to the spinal cord, outlining the extraction and clearing procedures. By streamlining these processes, this approach significantly enhances experimental efficiency and data integrity, thereby fostering advancements in neuroscience research and enabling more comprehensive investigations into the complexities of the central nervous system.

This study presents a protocol for extracting and preparing cleared whole-brain and spinal cord samples with preserved fluorescent signals, enhancing experimental efficiency and data integrity to advance neuroscience research.

マウス脳脊髄サンプルの抽出および組織透明化調製

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for a Rat Brain Tissue Sample

<a href='https://app.jove.com/v/61821/a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue'>Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).</a>This video demonstrates the method of hydrophobic tissue clearing of a rat brain tissue sample. The sample is sequentially dehydrated in methanol, treated with a dichloromethane and methanol mixture to dissolve lipids and pigments, and transferred to dibenzyl ether for complete tissue clearing, enabling detailed imaging without thin sectioning.

Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).This video demonstrates the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

ラット脳からの神経血管ユニットの分離法

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...