Este trabalho foi financiado por subvenções nih: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 & por T32 Training Grant 5T32GM081740

Todos os protocolos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Carolina do Sul.
1. Preparação da solução de estoque
<ol><li>Solução 1 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado adicione 100 mL de salina tamponada de fosfato de 10x (PBS) e 2 mL de Triton X-100.</li>
	<li>Solução 2 (1 L): A 900 mL de H2O desionizado, adicione 100 mL de 10x PBS, 2mL de Tween-20 e 1 mL de solução de estoque heparin de 10 mg/mL.</li>
	<li>Solução 3 (500 mL): A 400 mL da Solução 1, adicione 11,5 g de glicina e 100 mL de dimetilsulfoxida (DMSO).</li>
	<li>Solução 4 (50 mL): A 42 mL da Solução 1, adicione 3 mL de soro correspondente e 5 mL de DMSO.</li>
	<li>Solução de anticorpos primários (50 mL): A 46 mL da Solução 2, adicione 2,5 mL de DMSO e 1,5 mL de soro correspondente.</li>
	<li>Solução secundária de anticorpos (50 mL): A 48,5 mL da Solução 2, adicione 1,5 mL de soro correspondente. NOTA: Para a Solução 4, solução primária e solução secundária, use um soro que corresponda ao anticorpo secundário (por exemplo, cabra, cavalo, bovino).</li>
</ol>2. Preparação da amostra
NOTA: Realize as etapas 2.1 a 2.7 em um capô de fumaça devido a limitar a exposição ao PFA.
<ol><li>Anestesiar profundamente o rato jovem (3-6 semanas) usando sevoflurano; prossigam para 2.2 quando o rato não está respondendo e não responde ao dedo do dedo do dedo e da cauda.</li>
	<li>Coloque o rato em uma posição supina e faça uma incisão através da parede abdominal usando um par de tesouras Iris.</li>
	<li>Corte a parte inferior da caixa torácica até a clavícula em ambos os lados da caixa torácica usando a tesoura Mayo.</li>
	<li>Afixe o esterno e costelas longe do coração e pulmões com um hemostato.</li>
	<li>Fure o ventrículo esquerdo com uma agulha de 23 G presa a uma bomba de perfusão e corte o átrio direito com a tesoura Iris.</li>
	<li>Realizar perfusão transcárvia com aproximadamente 75 mL de 100 mM (1x) PBS.</li>
	<li>Continue a perfusão transcárvia com aproximadamente 100 mL de 4% de paraformaldeído (PFA) tamponado em 1x PBS.</li>
	<li>Remova o cérebro do crânio usando fórceps.</li>
	<li>Coloque o cérebro em posição sagital e corte em 4 seções iguais (aproximadamente 3 mm de largura) usando uma lâmina de barbear e uma matriz cerebral de rato.</li>
	<li>Fixar cada seção em 4% de PFA em 1x PBS em um tubo de plástico selado de 5mL durante a noite a 4 °C em um agitador.</li>
	<li>Continue a fixar em 4% pfa em 1x PBS à temperatura ambiente (RT) em um agitador por 1 h.</li>
	<li>Lave cada seção com 1x PBS em RT por 30 min, 3 vezes.</li>
</ol>3. Desidratação e despigmentação
<ol><li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 20% de metanol/80% para 1h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 40% de metanol/60% por 1h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 60% de metanol/40% para 1 h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 80% de metanol/20% para 1 h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em 100% de metanol por 1 h na RT. Repita com mais 100% de metanol, incubando por 1h na RT.</li>
	<li>Esfrie a amostra em 100% de metanol a 4° C por aproximadamente 10 minutos.</li>
	<li>Prepare uma solução de 66% de diclorometano (DCM)/33% de metanol.</li>
	<li>Incubar a amostra durante a noite na solução DCM/metanol na RT, com agitação.</li>
	<li>Lave com metanol na RT por 30 minutos, 2 vezes.</li>
	<li>Esfrie a amostra em 100% de metanol a 4° C por aproximadamente 10 minutos.</li>
	<li>Alvejante em peróxido de hidrogênio refrigerado, recém-preparado 5% em metanol durante a noite a 4° C.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 80% de metanol/20% para 1 h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 60% de metanol/40% para 1 h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 40% de metanol/60% por 1h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 20% de metanol/80% para 1h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em 1x PBS por 1 h na RT.</li>
	<li>Lave a solução 1 por 1h no RT, 2 vezes.</li>
</ol>4. Rotulagem de Subunidade de Toxina de Cólera B
<ol><li>Insira a ponta da agulha de 1 mL de seringa no local do núcleo accumbens.</li>
	<li>Injete lentamente 2,5 μL de 1% de biotina-CTB acima de 20 s.</li>
	<li>Deixe a ponta da agulha no lugar por 1 min e remova lentamente mais de 10 s para evitar vazamentos.</li>
</ol>5. Aplicação de anticorpos
<ol><li>Incubar a amostra na Solução 3 por 2 dias a 37 °C em um banho de água.</li>
	<li>Incubar a amostra na Solução 4 por 2 dias a 37 °C em banho-maria.</li>
	<li>Incubar com anticorpo primário por 7 dias a 37 °C em um banho de água.</li>
	<li>Lave a Solução 2 por 5 vezes, incubando 1h por lavagem. Armazene na Solução 2 na RT durante a noite.</li>
	<li>Incubar com anticorpo secundário por 7 dias a 37 °C no banho de água.</li>
	<li>Lave na Solução 2 por 5 vezes, incubando 1h por lavagem; armazenar na Solução 2 na RT durante a noite. NOTA: Todas as etapas a partir de 5,6 em diante, incluindo o armazenamento final, devem ocorrer com pouca luz. Os tubos de amostra podem ser protegidos com papel alumínio. As concentrações utilizadas para os anticorpos neste protocolo foram: TH às 1:100, Iba1 às 1:200, e o anticorpo secundário às 1:100. Adicione solução adicional 2 às etapas 5.1-5.6 para garantir que os tubos estejam completamente preenchidos.</li>
</ol>6. Limpeza de tecidos
<ol><li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 20% de metanol/80% para 1h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 40% de metanol/60% por 1h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 60% de metanol/40% para 1 h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em uma solução de água desionizada de 80% de metanol/20% para 1 h na RT.</li>
	<li>Incubar a amostra em 100% de metanol por 1h na RT.</li>
	<li>Incubar em fresco 100% metanol durante a noite na RT.</li>
	<li>Incubar em 66% DCM/33% de metanol por 3h, com agitação, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubar em éter dibenzyl (DBE) sem tremer. Deixe a amostra em DBE até limpar e armazene em DBE até a imagem.</li>
</ol>7. Montagem
<ol><li>Obtenha uma câmara impressa em 3D feita de resina Visijet M3 Crystal (modelos disponíveis no site da idisco.info).</li>
	<li>Fixar a câmara em um slide de microscópio usando um epóxi.</li>
	<li>Coloque a amostra no espaço quadrado no meio da câmara.</li>
	<li>Encha a câmara completamente com DBE.</li>
	<li>Coloque uma tampa de 0,17 mm de espessura sobre a câmara e aplique pressão até que o deslizamento tenha contato total com as paredes da câmara.</li>
	<li>Sele as bordas da tampa para a câmara usando o epóxi.</li>
	<li>Gire a câmara para permitir que bolhas de ar escapem da entrada de enchimento.</li>
	<li>Encha a câmara com DBE adicional.</li>
	<li>Sele a entrada de enchimento com epóxi e deixe a cura. NOTA: O excesso de DBE derramará durante a montagem.</li>
</ol>8. Imagem
<ol><li>Use um sistema de microscópio confocal para realizar z-scan na ampliação de 4x (veja o vídeo 3Danexado ).</li>
	<li>Obtenha excitação fluorescente da amostra usando um conjunto de laser para emitir em um comprimento de onda semelhante ao comprimento de onda especificado pelo anticorpo secundário. A excitação th foi alcançada utilizando um conjunto laser HeNe para emitir a 632 nm.</li>
	<li>Coloque o detector em um comprimento de onda perto da emissão de laser. Para o presente protocolo, o detector de TH foi fixado em 650 nm.</li>
	<li>Levante o ganho do detector até que haja um sinal visível. O ganho de 650LP para imagens foi definido como 7,50 B.</li>
	<li>Usando a opção Digitalizar no software de imagem confocal, mova o estágio do microscópio até que a amostra seja colocada em foco.</li>
	<li>Navegue ao redor do tecido em todas as planícies e obtenha imagens únicas ou z-stack usando o software de imagem confocal.</li>
	<li>Uma vez concluída a imagem, remova a amostra da câmara. Coloque-o de volta em um tubo completamente cheio de DBE e armazene no RT em um lugar escuro, de preferência coberto de papel alumínio. NOTA: As amostras podem ser remontadas e imagens desde que o sinal de floresnce ainda esteja forte.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

Nenhum dos autores tem conflitos de interesse para declarar.

A limpeza de tecidos oferece uma solução para as limitações do protocolo IHC tradicional. Uma amostra transparente minimiza a dispersão e absorção da luz, que fornece acesso óptico de nível celular a tecidos intactos18,19. As técnicas de limpeza de tecidos tornam um tecido transparente através da delipidação, descoloração e decalcificação com a administração de solventes. Uma vez que o índice refrativo da amostra de tecido corresponda ao índi...

Várias técnicas de limpeza tecidual foram validadas para uso no cérebro: hidrogel, hidrofílico e hidrofóbico. Essas técnicas visam tornar um tecido transparente através da delipidação, descoloração e decalcificação através da administração de solventes. Uma vez que o índice refrativo da amostra de tecido corresponda ao índice de refração do meio de imagem escolhido, uma imagem clara da amostra pode ser obtida. Técnicas baseadas em hidrogel, como clarity, protegem biomoléculas no tecido ligando-as a hidrogéis à base de acríl, o que evita danos estruturais e perda de proteínas1. No entanto, as técnicas de hidrogel utilizam produtos químicos severos do que têm o potencial de danificar tecidos mais frágeis, e amostras de tecido mais densas podem não ser compatíveis com o protocolo de hidrogel. Certas técnicas de hidrogel podem exigir equipamentos caros ou levar à expansão do tecido. Técnicas hidrofílicas, como o CUBIC, preservam a estrutura 3D através da formação de ligações de hidrogênio dentro do tecido2. A expansão tecidual também pode ocorrer em certo protocolo hidrofílico. A capacidade de compensação das técnicas hidrofílicas muitas vezes não corresponde à capacidade que as técnicas hidrofóbicas têm, o que é importante para tecidos mais densos e grossos3.
Técnicas hidrofóbicas geralmente são rápidas, não requerem equipamentos especiais e produzem uma amostra fácil de manusear e armazenar. IDISCO é uma técnica hidrofóbica que elimina o encolhimento que pode ocorrer em outro protocolo hidrofóbico. Originalmente, a técnica de limpeza de tecidos iDISCO foi descrita por Renier et al.4 para os embriões e órgãos adultos densos de camundongos. Esta técnica remove a água do tecido na etapa inicial de desidratação, reduzindo assim a dispersão da luz. O tecido é permeabilizado durante o pré-tratamento para permitir a penetração profunda de anticorpos. Os corantes de fluor alexa no espectro vermelho distante são usados para imunolabeling para evitar a autofluorescência do tecido em comprimentos de onda mais baixos5. Tecidos que passaram por protocolos de limpeza hidrofóbica são capazes de ser manuseados facilmente e podem ser imagens várias vezes devido à longevidade dos corantes Alexa Fluor. Se armazenados corretamente, os tecidos podem fornecer imagens por meses a um ano após o processamento inicial.
No presente protocolo, anticorpos tyrosine hydroxylase (TH), anticorpo Iba1 e Subunit B (CTB) de tricô de toxina de cólera e cólera foram usados em cérebros de ratos machos e femininos e transgênicos HIV-1 (Tg). O rato HIV-1 Tg possui sete dos nove genes que compõem o genoma viral hiv-1, o que leva a um modelo não infeccioso de exposição proteica hiv-1 a longo prazo6,7,8. Alterações dopaminérgicas já foram demonstradas anteriormente no rato HIV-1 Tg, e o próprio HIV-1 é uma doença inflamatória, por isso a escolha do anticorpo foi relevante para o desenho experimental9,10,11,12. CTB é um rastreador que se liga aos neurônios via ligação ganglioside e pode ser usado para traçar projeções diferentes no cérebro. A CTB tem sido usada anteriormente para estudar projeções do núcleo accumbens até a área de nigra substantia, duas áreas do cérebro fortemente envolvidas com as vias dopaminérgicas13,14,15.
Neste protocolo, o TH servirá como um marcador para a produção de dopamina, e o Iba1 marcará microglia ativada. O anticorpo TH usado rotula seletivamente uma única banda a aproximadamente 62 kDa que corresponde à hidroxilase de tirasina. O anticorpo Iba1 corresponde à sequência iba1 carboxy-terminal. Ambos os anticorpos foram criados em coelho e eram policlonais. CtB será usado para rastreamento retrógrado de neurônios da área de accumbens do núcleo até a área de nigra substantia. O protocolo atual também oferece uma diretriz para o ajuste do protocolo original iDISCO de duas maneiras distintas: 1) redução geral da coloração de fundo alterando os reagentes de soro nas etapas de bloqueio, e 2) dimensionamento do tempo de incubação para ser adequado para amostras de tecido maiores. No geral, o presente protocolo fornece evidências contínuas de que as técnicas de compensação hidrofóbica são viáveis nos tecidos cerebrais do rato, não têm interações prejudiciais perceptíveis com proteínas virais hiv-1 e são compatíveis com anticorpo TH, anticorpo Iba1 e CTB.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C34775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DBE</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DCM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>472301-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>G46-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>G9023-10mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>41121-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iba1 primary antibody</td>
			<td>FUJIFILM Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwik-sil epoxy</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860-1l-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP2944-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion machine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-062</td>
			<td>mini pump variable flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-3KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

Os métodos de limpeza de tecidos hidrofóbicos são procedimentos facilmente ajustáveis, rápidos e de baixo custo que permitem o estudo de uma molécula de interesse em amostras de tecidos não endalterados. Os procedimentos tradicionais de imunolabelação requerem o corte da amostra em seções finas, o que restringe a capacidade de rotular e examinar estruturas intactas. No entanto, se o tecido cerebral pode permanecer intacto durante o processamento, estruturas e circuitos podem permanecer intactos para a análise. Métodos de limpeza previamente estabelecidos levam tempo significativo para limpar completamente o tecido, e os produtos químicos severos podem muitas vezes danificar anticorpos sensíveis. O método iDISCO limpa rapidamente e completamente o tecido, é compatível com muitos anticorpos e não requer nenhum equipamento de laboratório especial. Esta técnica foi inicialmente validada para o uso em tecido de camundongos, mas o protocolo atual adapta esse método a hemisférios de imagem de control e cérebros de ratos transgênicos. Além disso, o presente protocolo também faz vários ajustes no protocolo pré-existente para fornecer imagens mais claras com menor coloração de fundo. Os anticorpos para Iba-1 e hidroxilase de tyrosina foram validados no rato transgênico HIV-1 e em ratos de controle F344/N usando o presente método de limpeza de tecido hidrofóbico. O cérebro é uma rede entrelaçada, onde as estruturas trabalham juntas mais frequentemente do que separadamente umas das outras. Analisar o cérebro como um todo o sistema em oposição a uma combinação de peças individuais é o maior benefício de todo esse método de limpeza cerebral.

A limpeza completa de grandes seções do tecido cerebral de rato F344/N e HIV-1 foi alcançada usando este protocolo de limpeza de tecido hidrofóbico modificado. A Figura 1 exibe uma imagem confocal típica para TH na região de nigra substantia. A Figura 1A representa uma mancha densa e positiva. Áreas densas como essas podem ser analisadas focando-se através do plano "Z" para confirmar a coloração positiva e a morfologia celular adequada. <strong class="...

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A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Aqui apresentamos um método de limpeza de tecido hidrofóbico que permite a visualização de moléculas-alvo como parte de estruturas cerebrais intactas. Esta técnica foi validada para o controle F344/N e ratos transgênicos HIV-1 de ambos os sexos.

Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K visualizações.  University of South Carolina. Aqui apresentamos um método de limpeza de tecido hidrofóbico que permite a visualização de moléculas-alvo como parte de estruturas cerebrais intactas. Esta técnica foi validada para o controle F344/N e ratos transgênicos HIV-1 de ambos os sexos.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparação do Tecido Cerebral de Rato imunomicroscopia

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Neurociência

Chromatin Immunoprecipitation from Dorsal Root Ganglia Tissue following Axonal Injury

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after injury (Teng et al., 2006). It is recognized that transcriptional programs essential for neurite and axonal outgrowth are 
reactivated upon injury in the PNS (Makwana et al., 2005). However the tools available to analyze neuronal gene regulation in vivo are limited and 
often challenging.
The dorsal root ganglia (DRG) offer an excellent injury model system because both the CNS and PNS are innervated by a 
bifurcated axon originating from the same soma. The ganglia represent a discrete collection of cell bodies where all transcriptional events occur, 
and thus provide a clearly defined region of transcriptional activity that can be easily and reproducibly removed from the animal. Injury of nerve 
fibers in the PNS (e.g. sciatic nerve), where axonal regeneration does occur, should reveal a set of transcriptional programs that are distinct from 
those responding to a similar injury in the CNS, where regeneration does not take place (e.g. spinal cord). Sites for transcription factor binding, 
histone and DNA modification resulting from injury to either PNS or CNS can be characterized using chromatin immunoprecipitation (ChIP). 
Here, we describe a ChIP protocol using fixed mouse DRG tissue following axonal injury. This powerful combination provides a means for characterizing the pro-regeneration chromatin environment necessary for promoting axonal regeneration.

We present a method for chromatin immunoprecipitation from dorsal root ganglia tissue following axonal injury. The approach can be used to identify specific transcription factor binding sites and epigenetic modification of histone and DNA important for the regeneration of injured axons in both the peripheral and central nervous system.

Cromatina imunoprecipitação de Tissue Dorsal Root Gânglios seguintes Lesão Axonal

Axons in the central nervous system (CNS) do not regenerate while those in the peripheral nervous system (PNS) do regenerate 
to a limited extent after ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

Primer for Immunohistochemistry on Cryosectioned Rat Brain Tissue: Example Staining for Microglia and Neurons

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brain tissue, using markers for microglia and neuronal elements as an example. Specifically, this paper is a step-by-step protocol for fluorescent visualization of microglia and neurons via immunohistochemistry for Iba1 and Pan-neuronal, respectively. Fluorescence double-labeling is particularly useful for the localization of multiple proteins within the same sample, providing the opportunity to accurately observe interactions between cell types, receptors, ligands, and/or the extracellular matrix in relation to one another as well as protein co-localization within a single cell. Unlike other visualization techniques, fluorescence immunohistochemistry staining intensity may decrease in the weeks to months following staining, unless appropriate precautions are taken. Despite this limitation, in many applications fluorescence double-labeling is preferred over alternatives such as 3,3&#39;-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) or alkaline phosphatase (AP), as fluorescence is more time efficient and allows for more precise differentiation between two or more markers. The discussion includes troubleshooting tips and advice to promote success.

This introductory level protocol describes the reagents, equipment, and techniques required to complete immunohistochemical staining of rodent brains, using markers for microglia and neuronal elements as an example.

Primer para imunohistoquímica em tecido criosseccionada cérebro de um rato: Exemplo de coloração para Microglia e Neurônios

Immunohistochemistry is a widely used technique for detecting the presence, location, and relative abundance of antigens in situ. This introductory level ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant cell type in the brain, neurons are the most widely studied of these cell types given their direct role in impacting behaviors. Other cell types in the brain also impact neuronal function and behavior via the signaling molecules they produce. Neuroscientists must understand the interactions between the cell types in the brain to better understand how these interactions impact neural function and disease. To date, the most common method of analyzing protein or gene expression utilizes the homogenization of whole tissue samples, usually with blood, and without regard for cell type. This approach is an informative approach for examining general changes in gene or protein expression that may influence neural function and behavior; however, this method of analysis does not lend itself to a greater understanding of cell-type-specific gene expression and the effect of cell-to-cell communication on neural function. Analysis of behavioral epigenetics has been an area of growing focus which examines how modifications of the deoxyribonucleic acid (DNA) structure impact long-term gene expression and behavior; however, this information may only be relevant if analyzed in a cell-type-specific manner given the differential lineage and thus epigenetic markers that may be present on certain genes of individual neural cell types. The Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) technique described below provides a simple and effective way to isolate individual neural cells for the subsequent analysis of gene expression, protein expression, or epigenetic modifications of DNA. This technique can also be modified to isolate more specific neural cell types in the brain for subsequent cell-type-specific analysis.

The goal of this protocol is to use the fluorescence activated cell sorting (FACS) technique to sort specific types of neural cells for subsequent analysis of cell-type-specific gene expression, epigenetic markers, and or protein expression.

Usando fluorescência celular ativado Classificando a Examine-Cell-tipo específico Expressão Gênica em Tissue cérebro de um rato

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Um modelo do rato de leve hipoperfusão intra-uterino com estenose Microcoil

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, a multitude of novel clearing methodologies including CUBIC (clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis), SWITCH (system-wide control of interaction time and kinetics of chemicals), MAP (magnified analysis of the proteome), and PACT (passive clarity technique), have been established to further expand the existing toolkit for the microscopic analysis of biological tissues. The present study aims to improve upon and optimize the original PACT procedure for an array of intact rodent tissues, including the whole central nervous system (CNS), kidneys, spleen, and whole mouse embryos. Termed psPACT (process-separate PACT) and mPACT (modified PACT), these novel techniques provide highly efficacious means of mapping cell circuitry and visualizing subcellular structures in intact normal and pathological tissues. In the following protocol, we provide a detailed, step-by-step outline on how to achieve maximal tissue clearance with minimal invasion of their structural integrity via psPACT and mPACT.

Here, we present two novel methodologies, psPACT and mPACT, for achieving maximal optical transparency and subsequent microscopic analysis of tissue vasculature in the intact rodent whole CNS.

Passivo novo métodos de compensação para a produção rápida de transparência óptica no tecido inteiro do CNS

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

Isolamento dos capilares cerebrais do tecido do cérebro humano fresco

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining and imaging of thick brain samples. However, this advanced technology has not yet been used for whole-mount retinas. Although the retina is partially transparent, its thickness of approximately 200 &#181;m (in mice) still limits the penetration of antibodies into the deep tissue as well as reducing light penetration for high-resolution imaging. Here, we adapted the CLARITY method for whole-mount mouse retinas by polymerizing them with an acrylamide monomer to form a nanoporous hydrogel and then clearing them in sodium dodecyl sulfate to minimize protein loss and avoid tissue damage. CLARITY-processed retinas were immunostained with antibodies for retinal neurons, glial cells, and synaptic proteins, mounted in a refractive index matching solution, and imaged. Our data demonstrate that CLARITY&#160;can improve the quality of standard immunohistochemical staining and imaging for retinal neurons and glial cells in whole-mount preparation. For instance, 3D resolution of fine axon-like and dendritic structures of dopaminergic amacrine cells were much improved by CLARITY. Compared to non-processed whole-mount retinas, CLARITY can reveal immunostaining for synaptic proteins such as postsynaptic density protein 95. Our results show that CLARITY renders the retina more optically transparent after the removal of lipids and preserves fine structures of retinal neurons and their proteins, which can be routinely used for obtaining high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures in whole-mount preparation.

Here we present a protocol to adapt the CLARITY method of the brain tissues for whole-mount retinas to improve the quality of standard immunohistochemical staining and high-resolution imaging of retinal neurons and their subcellular structures.

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...