Name: a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue
Uploaded: 2020-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
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이 작품은 NIH 보조금에 의해 지원되었다: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 및 T32 교육 보조금 5T32GM081740

모든 동물 프로토콜은 사우스 캐롤라이나 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 검토되고 승인되었습니다.
1. 주식 솔루션 준비
<ol><li>용액 1 (1 L): 900 mL의 탈이온화 H2O는 10배 인산완충식식염(PBS)과 트리톤 X-1002mL의 100mL를 추가한다.</li>
	<li>솔루션 2 (1 L): 900 mL의 deionized H2O, 10x PBS의 100 mL, 20 tween-20의 2mL 및 10 mg / mL Heparin 재고 용액의 1 mL을 추가하십시오.</li>
	<li>용액 3 (500 mL): 용액 1의 400 mL에 11.5 g의 글리신과 100 mL의 디메틸술플옥사이드 (DMSO)를 추가하십시오.</li>
	<li>솔루션 4 (50 mL): 용액 1의 42 mL에 해당 혈청 3mL 및 DMSO 5 mL을 추가하십시오.</li>
	<li>1차 항체 용액(50mL): 용액 2의 46mL에 2.5mL의 DMSO 와 1.5mL의 해당 혈청을 추가한다.</li>
	<li>이차 항체 용액 (50 mL): 용액 2의 48.5 mL에, 해당 혈청의 1.5 mL을 추가합니다. 참고: 용액 4, 1차 용액 및 이차 용액의 경우 이차 항체(예: 염소, 말, 소)와 일치하는 혈청을 사용합니다.</li>
</ol>2. 샘플 준비
참고: PFA에 대한 노출을 제한하기 때문에 연기 후드에서 2.1~2.7단계를 수행합니다.
<ol><li>세보플루란을 사용하여 젊은 (3-6 주) 쥐를 심층 마취; 쥐가 반응하지 않고 발가락과 꼬리 꼬집어 반응하지 않을 때 2.2로 진행하십시오.</li>
	<li>쥐를 supine 위치에 놓고 홍채 가위를 사용하여 복부 벽을 통해 절개를합니다.</li>
	<li>마요 가위를 사용하여 늑골 케이지의 바닥을 통해 갈비뼈 의 양쪽에 있는 쇄골까지 잘라냅니다.</li>
	<li>흉골과 갈비뼈를 심장과 폐에서 헤모스트와 분리합니다.</li>
	<li>관류 펌프에 부착된 23G 바늘로 왼쪽 심실을 관통하고 아이리스 가위로 오른쪽 아트리움을 잘라냅니다.</li>
	<li>100mMMM(1x) PBS의 약 75mL로 경동맥 관류를 수행합니다.</li>
	<li>1x PBS로 완충된 약 100mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)로 경전 관류를 계속합니다.</li>
	<li>집게를 사용하여 두개골에서 뇌를 제거합니다.</li>
	<li>뇌를 적중 한 위치에 놓고 면도날과 쥐 뇌 매트릭스를 사용하여 4 개의 동일한 섹션 (너비약 3mm)으로 슬라이스합니다.</li>
	<li>각 섹션을 4% PFA로 1x PBS로 밀봉된 5mL 플라스틱 튜브에서 셰이커에 4°C로 하룻밤 동안 고정합니다.</li>
	<li>1 시간 동안 셰이커에 실온 (RT)에서 1 x PBS에서 4 % PFA로 계속 수정하십시오.</li>
	<li>각 섹션을 RT에서 1x PBS로 30분, 3회 세척합니다.</li>
</ol>3. 탈수 및 탈색
<ol><li>RT에서 1h에 대해 20% 메탄올/80%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>샘플을 RT에서 1h에 대해 40% 메탄올/60% 탈온화된 물 용액으로 배양합니다.</li>
	<li>60% 메탄올/40% 탈이온화된 물 용액에서 1h의 RT에 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>RT에서 1h에 대해 80% 메탄올/20%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>100% 메탄올에 100% 메탄올을 1시간 동안 배양하여 RT에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>샘플을 4°C에서 100% 메탄올로 약 10분 동안 식힙니다.</li>
	<li>66% 디클로로메탄(DCM)/33% 메탄올 용액을 준비한다.</li>
	<li>RT의 DCM/메탄올 용액에서 밤새 샘플을 배양하고 흔들어 보임합니다.</li>
	<li>RT에서 메탄올로 30분, 2회 세척합니다.</li>
	<li>샘플을 4°C에서 100% 메탄올로 약 10분 동안 식힙니다.</li>
	<li>4° C에서 하룻밤 동안 메탄올에서 고추, 갓 준비 된 5 % 과산화수소표백.</li>
	<li>RT에서 1h에 대해 80% 메탄올/20%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>60% 메탄올/40% 탈이온화된 물 용액에서 1h의 RT에 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>샘플을 RT에서 1h에 대해 40% 메탄올/60% 탈온화된 물 용액으로 배양합니다.</li>
	<li>RT에서 1h에 대해 20% 메탄올/80%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>RT에서 1시간 동안 1배 의 PBS로 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>RT에서 1시간, 2회 용액 1시에 세척합니다.</li>
</ol>4. 콜레라 톡신 서브유닛 B 라벨링
<ol><li>1 mL 주사기의 바늘 끝을 핵 accumbens 부위에 삽입합니다.</li>
	<li>20s 이상 1%의 비오틴-CTB의 2.5 μL을 천천히 주입하십시오.</li>
	<li>바늘 끝을 1 분 동안 제자리에 두고 누출을 방지하기 위해 10 s 이상 천천히 제거하십시오.</li>
</ol>5. 항체 응용 프로그램
<ol><li>수조에서 37°C에서 2일 동안 용액 3에서 샘플을 배양한다.</li>
	<li>수조에서 37°C에서 2일 동안 용액 4에서 샘플을 배양한다.</li>
	<li>수조에서 37°C에서 7일 동안 1차 항체를 배양한다.</li>
	<li>용액 2를 5회 세척하여 세척당 1h로 배양합니다. 하룻밤 RT에서 솔루션 2에 저장합니다.</li>
	<li>수조에서 37 °C에서 7 일 동안 이차 항체로 배양하십시오.</li>
	<li>용액 2에서 5회 세척하여 세척당 1h를 배양합니다. 하룻밤 RT에서 솔루션 2에 저장합니다. 참고: 최종 저장소를 포함하여 5.6 단계 이후의 모든 단계는 저조도에서 발생해야 합니다. 샘플 튜브는 알루미늄 호일로 차폐될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 항체에 사용되는 농도는 1:100에서 TH, 1:200에서 Iba1, 및 1:100에 이차 항체가 있었다. 5.1-5.6 단계에 추가 솔루션 2를 추가하여 튜브가 완전히 채워지도록 합니다.</li>
</ol>6. 조직 청산
<ol><li>RT에서 1h에 대해 20% 메탄올/80%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>샘플을 RT에서 1h에 대해 40% 메탄올/60% 탈온화된 물 용액으로 배양합니다.</li>
	<li>60% 메탄올/40% 탈이온화된 물 용액에서 1h의 RT에 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>RT에서 1h에 대해 80% 메탄올/20%의 탈온화된 물 용액으로 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>RT에서 1시간 동안 100% 메탄올로 샘플을 배양합니다.</li>
	<li>RT에서 하룻밤 사이에 신선한 100 % 메탄올로 배양하십시오.</li>
	<li>66% DCM/33% 메탄올에서 3시간 동안, 실온에서 흔들림을 가합니다.</li>
	<li>디벤질 에테르 (DBE)에서 흔들리지 않고 인큐베이션하십시오. 샘플을 DBE에 보관하여 이미징이 명확해질 때까지 보관하십시오.</li>
</ol>7. 마운팅
<ol><li>Visijet M3 크리스탈 수지 (idisco.info 웹 사이트에서 사용할 수있는 템플릿)으로 만든 3D 인쇄 챔버를 가져옵니다.</li>
	<li>에폭시를 사용하여 현미경 슬라이드에 챔버를 고정합니다.</li>
	<li>샘플을 챔버 중앙에 있는 사각형 공간에 놓습니다.</li>
	<li>DBE로 챔버를 완전히 채웁니다.</li>
	<li>챔버 위에 0.17mm 두께의 커버슬립을 놓고 커버슬립이 챔버 벽과 완전히 접촉할 때까지 압력을 가합니다.</li>
	<li>에폭시를 사용하여 커버슬립의 가장자리를 챔버로 밀봉합니다.</li>
	<li>기포가 충전 입구에서 탈출할 수 있도록 챔버를 회전합니다.</li>
	<li>추가 DBE로 챔버를 채웁니다.</li>
	<li>충전 입구를 에폭시로 밀봉하고 치료할 수 있습니다. 참고: 장착 하는 동안 초과 DBE 유출 됩니다.</li>
</ol>8. 이미징
<ol><li>공초점 현미경 시스템을 사용하여 4배배율에서 z 스캔을 수행합니다(첨부된 3D 비디오참조).</li>
	<li>이차 항체에 의해 지정된 파장과 유사한 파장에서 방출하는 레이저 세트를 사용하여 시료의 형광 내수를 달성한다. TH 흥분은 632 nm에서 방출하는 Hene 레이저 세트를 활용하여 달성되었다.</li>
	<li>검출기를 레이저 방출에 가까운 파장에 설정합니다. 본 프로토콜의 경우 TH용 검출기는 650nm로 설정되었다.</li>
	<li>가시신호가 있을 때까지 검출기의 게인을 올립니다. 이미지에 대한 650LP 게인은 7.50 B로 설정되었습니다.</li>
	<li>공초점 이미징 소프트웨어에서 스캔 옵션을 사용하여 샘플이 초점을 맞출 때까지 현미경 단계를 이동합니다.</li>
	<li>모든 평원의 조직을 탐색하고 공초점 이미징 소프트웨어를 사용하여 단일 이미지 또는 z 스택 이미지를 가져옵니다.</li>
	<li>이미징이 완료되면 챔버에서 샘플을 제거합니다. DBE로 가득 찬 튜브에 다시 넣고 알루미늄 호일로 덮인 어두운 곳에 RT에 보관하십시오. 참고: 꽃집 신호가 여전히 강한 한 샘플을 다시 마운트하고 이미지화할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298 (2020).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+a+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+brain+activity+by+automated+volume+analysis+of+immediate+early+genes.">Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction.">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).</li><li>Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HIV-1+transgenic+rat+model+of+neuroHIV.">The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins,+Tat+and+gp120,+target+the+developing+dopamine+system.">HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system.</a> Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).</li><li>Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+and+cocaine+disrupt+dopamine+reuptake+and+medium+spiny+neurons+in+female+rat+striatum.">HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum.</a> PLos One. 12 (11), 0188404 (2017).</li><li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry.">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Science Report. 8, 6152 (2018).</li><li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure.">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).</li><li>Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmental+distribution+of+ventral+striatal+neurons+projecting+to+the+mesencephalon+in+the+rat.">Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat.</a> Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).</li><li>Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+afferents+to+the+rat+dorsal+raphe+nucleus+demonstrated+by+retrograde+and+anterograde+tracing+methods.">Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods.</a> Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).</li><li>Barrot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Braking+dopamine+systems:+a+new+GABA+master+structure+for+mesolimbic+and+nigrostriatal+functions.">Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).</li><li>Roostalu, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole-brain+3D+imaging+of+tyrosine+hydroxylase-labeled+neuron+architecture+in+the+mouse+MPTP+model+of+Parkinson's+disease.">Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (11), (2019).</li><li>Ransohoff, R., Cardona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myeloid+cells+of+the+central+nervous+system+parenchyma.">The myeloid cells of the central nervous system parenchyma.</a> Nature. 468, 253-262 (2010).</li><li>Rocha, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Clearing+and+Light+Sheet+Microscopy:+Imaging+the+Unsectioned+Adult+Zebra+Finch+Brain+at+Cellular+Resolution.">Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13 (2019).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+tissue+clearing.">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li></ol>

어떤 저자도 선언할 이해 상충이 없습니다.

조직 정리는 기존의 IHC 프로토콜의 한계에 대한 해결책을 제공합니다. 투명한 시료는 빛의 산란과 흡수를 최소화하여,18,19의그대로 조직에 대한 세포 수준 광학 액세스를 제공한다. 조직 클리어링 기술은 용매의 투여와 함께 탈색, 탈색 및 탈화를 통해 조직을 투명하게 돌립니다. 조직 샘플의 굴절률이 선택한 이미징 매체의 굴절률과 일치하면 샘플이 ?...

여러 조직 클리어링 기술은 뇌의 사용을 위해 검증되었습니다: 소수겔, 친수성 및 소수성. 이러한 기술은 용매의 투여를 통해 탈색, 탈색 및 탈화를 통해 조직을 투명하게 전환하는 것을 목표로 합니다. 조직 샘플의 굴절률이 선택한 이미징 매체의 굴절률과 일치하면 시료의 명확한 이미지를 얻을 수 있습니다. CLARITY와 같은 하이드로겔 기반 기술은 아크릴 기반 하이드로겔에 연결하여 조직 내 생체 분자를 확보하여 단백질1의구조적 손상 과 손실을 방지합니다. 그러나 하이드로겔 기술은 더 연약한 조직을 손상시킬 수 있는 가능성이 있는 것보다 가혹한 화학 물질을 이용하며, 조밀한 조직 샘플은 하이드로겔 프로토콜과 호환되지 않을 수 있습니다. 특정 하이드로겔 기술은 고가의 장비가 필요하거나 조직 팽창으로 이어질 수 있습니다. 큐빅과 같은 친수성 기술은 조직2내의 수소 결합 형성을 통해 3D 구조를 보존한다. 조직 확장은 또한 특정 친수성 프로토콜에서 발생할 수 있습니다. 친성 기종의 청산 능력은 종종 소수성 기술이 가지고있는 능력과 일치하지 않으며, 이는 조밀하고 두꺼운 조직에 중요하다3.
소수성 기술은 일반적으로 빠르며 특수 장비가 필요하지 않으며 취급 및 보관이 쉬운 샘플을 생성합니다. iDISCO는 다른 소수성 프로토콜에서 발생할 수 있는 수축을 제거하는 소수성 기술입니다. 원래, iDISCO 조직 청산 기술은 쥐의 배아 및 조밀한, 성인 장기에 대한 Renier 외4에 의해 설명되었다. 이 기술은 초기 탈수 단계에서 조직에서 물을 제거하여 빛 산란을 줄입니다. 조직은 깊은 항체 침투를 허용하기 위하여 전처리 도중 permeabilized됩니다. 극한 스펙트럼에서 알렉사 플루오 염료는 낮은 파장5에서조직의 자가 불화를 피하기 위해 면역 라벨링에 사용된다. 소수성 청산 프로토콜을 거친 조직은 쉽게 처리될 수 있으며 Alexa Fluor 염료의 수명으로 인해 여러 번 이미지화될 수 있습니다. 제대로 저장하면 조직은 초기 처리 후 몇 달에서 1 년 동안 이미지를 제공 할 수 있습니다.
본 프로토콜에서 티로신 하이드록실라제(TH) 항체, 이바1 항체 및 콜레라 톡신 서브유닛 B(CTB)는 남성과 여성 제어 및 HIV-1 형질(Tg) 쥐 뇌 모두에 사용되었다. HIV-1 Tg 랫트는 HIV-1 바이러스 게놈을 구성하는 9개의 유전자 중 7개를 가지고 있으며, 이는 장기 HIV-1 단백질 노출6,7,8의비감염성 모델로 이어진다. 도파민성 변화는 이전에 HIV-1 Tg 랫트에서 입증되었으며, HIV-1 자체는 염증성 질환이므로 항체 선택은 실험 설계9,10,11,12와관련이 있었다. CTB는 신경질 옆 바인딩을 통해 뉴런에 부착하고 뇌의 포퍼런트 프로젝션을 추적하는 데 사용할 수있는 추적자입니다. CTB는 이전에 핵 accumbens에서 실질적인 니그라 영역, 도파민 경로와 크게 관련된 뇌의 두영역(13,14,15)에대한 투영을 연구하는 데 사용되었습니다.
이 프로토콜에서 TH는 도파민 생산을 위한 마커 역할을 하며, Iba1은 활성화된 마이크로글리아를 표시합니다. TH 항체는 티로신 하이드록실라제에 해당하는 약 62kDa에서 단일 대역에 선택적으로 라벨을 부착하는 데 사용되었습니다. Iba1 항체는 Iba1 카복시-말단 서열에 해당한다. 두 항체는 토끼에서 자랐고 폴리클론이었다. CTB는 핵 accumbens 영역에서 실질적인 니그라 영역까지 뉴런의 역행 추적에 사용됩니다. 현재 프로토콜은 또한 두 가지 방법으로 원래 iDISCO 프로토콜의 조정을 위한 지침을 제공합니다: 1) 차단 단계에서 혈청 시약을 변경하여 배경 염색의 전반적인 감소, 그리고 2) 큰 조직 샘플에 적합 하도록 인큐베이션 시간의 스케일링. 전반적으로, 본 프로토콜은 소수성 청산 기술이 쥐의 뇌 조직에서 실현 가능하고, HIV-1 바이러스 성 단백질과 눈에 띄는 해로운 상호 작용이 없으며, TH 항체, Iba1 항체 및 CTB와 호환된다는 지속적인 증거를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Cholera Toxin Subunit B (Recombinant), Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>C34775</td><td></td></tr><tr><td>DBE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Chemical</td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor Plus 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32733</td><td></td></tr><tr><td>Goat serum</td><td>Sigma Life Science</td><td>G9023-10mL</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Acros Organics</td><td>41121-0010</td><td></td></tr><tr><td>Iba1 primary antibody</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Kwik-sil epoxy</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-1l-R</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2944-100</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion machine</td><td>VWR</td><td>70730-062</td><td>mini pump variable flow</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-3KG</td><td></td></tr><tr><td>TH primary antibody</td><td>Millipore Sigma</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr></tbody></table>

a hydrophobic tissue clearing method for rat brain tissue

소수성 조직 청산 방법은 변경되지 않은 조직 샘플에 대한 관심 분자의 연구를 허용하는 쉽게 조절 가능하고 빠르며 저렴한 절차입니다. 기존의 면역 라벨링 절차는 샘플을 얇은 섹션으로 절단해야 하므로 손상되지 않은 구조물에 라벨을 부착하고 검사하는 기능이 제한됩니다. 그러나, 뇌 조직이 처리 하는 동안 그대로 남아 있는 경우, 구조 및 회로 분석을 위해 그대로 남아 있습니다. 이전에 확립 된 클리어링 방법은 조직을 완전히 지우는 데 상당한 시간이 걸리며 가혹한 화학 물질은 종종 민감한 항체를 손상시킬 수 있습니다. iDISCO 방법은 조직을 신속하고 완전히 지우고 많은 항체와 호환되며 특별한 실험실 장비가 필요하지 않습니다. 이 기술은 마우스 조직에서 사용하기 위해 처음에 검증되었지만 현재 프로토콜은 이 방법을 제어 및 형질 전환 쥐 뇌의 이미지 반구에 적응시합니다. 이 외에도 현재 프로토콜은 기존 프로토콜을 여러 번 조정하여 배경 염색이 적은 선명한 이미지를 제공합니다. 이바-1 및 티로신 하이드록실라제에 대한 항체는 HIV-1 형질전환 쥐및 F344/N 대조군 쥐에서 현재소수성 조직 청산 방법을 사용하여 검증되었다. 뇌는 서로 분리된 것보다 구조가 더 자주 함께 작동하는 얽힌 네트워크입니다. 개별 조각의 조합반대로 전체 시스템으로 뇌를 분석하는 것은이 전체 뇌 청산 방법의 가장 큰 이점입니다.

F344/N 과 HIV-1 쥐 뇌 조직의 큰 부분을 완전히 지우는 이 변형된 소수성 조직 청산 프로토콜을 사용하여 달성되었다. 도 1은 실질적인 니그라 영역에서 TH에 대한 일반적인 공초점 이미지를 표시한다. 도 1A는 조밀하고 양적인 염색을 나타냅니다. 이와 같은 조밀한 영역은 "Z" 평면을 통해 초점을 맞추어 양성 염색 및 적절한 세포 형태를 확인함으로써 구문...

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A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

여기서 우리는 손상되지 않은 뇌 구조의 일환으로 표적 분자의 보기를 허용하는 소수성 조직 청산 방법을 제시합니다. 이 기술은 지금 F344/N 통제 및 두 남녀의 HIV-1 형질전환 쥐를 위해 검증되었습니다.

쥐 뇌 조직을 위한 소수성 조직 청산 방법

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K 조회수.  University of South Carolina. 여기서 우리는 손상되지 않은 뇌 구조의 일환으로 표적 분자의 보기를 허용하는 소수성 조직 청산 방법을 제시합니다. 이 기술은 지금 F344/N 통제 및 두 남녀의 HIV-1 형질전환 쥐를 위해 검증되었습니다.

비디오: A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

2-Vessel Occlusion/Hypotension: A Rat Model of Global Brain Ischemia

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ischemia produces damage to specific brain regions shown to be highly sensitive to ischemia 1. Hippocampal neurons have higher sensitivity to ischemic insults compared to other cell populations, and specifically, the CA1 region of the hippocampus is particularly vulnerable to ischemia/reperfusion 2.
The design of therapeutic interventions, or study of mechanisms involved in cerebral damage, requires a model that produces damage similar to the clinical condition and in a reproducible manner. Bilateral carotid vessel occlusion with hypotension (2VOH) is a model that produces reversible forebrain ischemia, emulating the cerebral events that can occur during cardiac arrest and resuscitation. We describe a model modified from Smith et al. (1984) 2, as first presented in its current form in Sanderson, et al. (2008) 3, which produces reproducible injury to selectively vulnerable brain regions 3-6. The reliability of this model is dictated by precise control of systemic blood pressure during applied hypotension, the duration of ischemia, close temperature control, a specific anesthesia regimen, and diligent post-operative care. An 8-minute ischemic insult produces cell death of CA1 hippocampal neurons that progresses over the course of 6 to 24 hr of reperfusion, while less vulnerable brain regions are spared. This progressive cell death is easily quantified after 7-14 days of reperfusion, as a near complete loss of CA1 neurons is evident at this time.
In addition to this brain injury model, we present a method for CA1 damage quantification using a simple, yet thorough, methodology. Importantly, quantification can be accomplished using a simple camera-mounted microscope, and a free ImageJ (NIH) software plugin, obviating the need for cost-prohibitive stereology software programs and a motorized microscopic stage for damage assessment.

Bilateral carotid occlusion coupled with systemic hypotension produces global brain ischemia in the rat, resulting in damage to the hippocampus with reproducible severity. Animal subjects are impaired with predictable patterns of brain damage, they recover expediently, and mortality rates are comparatively low.

2 혈관 폐색 / 저혈압 : 세계적인 두뇌 국소 빈혈의 쥐 모델

Cardiac arrest followed by resuscitation often results in dramatic brain damage caused by ischemia and subsequent reperfusion of the brain. Global brain ...

연구

의학

Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic resonance (MR) microscopy data. While it is possible to perform MR collections on living, excised mammalian tissue, such experiments have traditionally been constrained by resolution limits and are thus incapable of visualizing tissue microstructure. Conversely, MR protocols that did achieve microscopic image resolution required the use of fixed samples to accommodate the need for static, unchanging conditions over lengthy scan times. The current protocol describes the first available MR technique that enables imaging of living, mammalian tissue samples at microscopic resolutions. Such data is of great importance to the understanding of how pathology-based contrast changes occurring at the microscopic level influence the content of macroscopic MR scans such as those used in the clinic. Once such an understanding is realized, diagnostic methods with greater sensitivity and accuracy can be developed, which will translate directly to earlier disease treatment, more accurate therapy monitoring and improved patient outcomes.
While the described methodology focuses on brain slice preparations, the protocol is adaptable to any excised tissue slice given that changes are made to the gas and perfusate preparations to accommodate the tissue&#39;s specific metabolic needs. Successful execution of the protocol should result in living, acute slice preparations that exhibit MR diffusion signal stability for periods up to 15.5 h. The primary advantages of the current system over other MR compatible perfusion apparatuses are its compatibility with the MR microscopy hardware required to attain higher resolution images and ability to provide constant, uninterrupted flow with carefully regulated perfusate conditions. Reduced sample throughput is a consideration with this design as only one tissue slice may be imaged at a time.

The current protocol describes a method by which users can maintain viability of acute hippocampal and cortical slice preparations during the collection of magnetic resonance microscopy data.

대사 지원 Excised, 자기 공명 현미경 중 생활 뇌 조직

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

생체공학

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass Spectrometry (IMS) experiments. Determining the appropriate protocol to follow throughout the sample preparation process can be difficult as each step must be optimized to comply with the unique characteristics of the analytes of interest. This process involves not only finding a compatible matrix that can desorb and ionize the molecules of interest efficiently, but also selecting the appropriate matrix deposition technique. For example, a wet matrix deposition technique, which entails dissolving a matrix in solvent, is superior for desorption of most proteins and peptides, whereas dry matrix deposition techniques are particularly effective for ionization of lipids. Sublimation has been reported as a highly efficient method of dry matrix deposition for the detection of lipids in tissue by MALDI IMS due to the homogeneity of matrix crystal deposition and minimal analyte delocalization as compared to many wet deposition methods 1,2. Broadly, it involves placing a sample and powdered matrix in a vacuum-sealed chamber with the samples pressed against a cold surface. The apparatus is then lowered into a heated bath (sand or oil), resulting in sublimation of the powdered matrix onto the cooled tissue sample surface. Here we describe a sublimation protocol using 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matrix for the detection and visualization of gangliosides in the rat brain using MALDI IMS.

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

MALDI 이미징 질량 분석에 대한 쥐 뇌 조직에 강글리오사이드의 감지 및 시각화를위한 DAN 매트릭스의 승화

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

신경과학

A Micro-CT-based Method for Characterizing Lesions and Locating Electrodes in Small Animal Brains

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that requires manual estimation. Here, we describe a simple, straightforward method for quantifying lesions and locating electrodes in the brain that is less laborious and yields more detailed results. Whole brains are stained with osmium tetroxide, embedded in resin, and imaged with a micro-CT scanner. The scans result in 3D digital volumes of the brains with resolutions and virtual section thicknesses dependent on the sample size (12&#8211;15 and 5&#8211;6 &#181;m&#160;per voxel for rat and zebra finch brains, respectively). Surface and deep lesions can be characterized, and single tetrodes, tetrode arrays, electrolytic lesions, and silicon probes can also be localized. Free and proprietary software allows experimenters to examine the sample volume from any plane and segment the volume manually or automatically. Because this method generates whole brain volume, lesions and electrodes can be quantified to a much higher degree than in current methods, which will help standardize comparisons within and across studies.

This article describes a straightforward method to prepare small animal brains for micro-CT imaging, in which lesions can be quantified and electrodes located with high precision in the context of the whole brain.

병 변 특성화 및 작은 동물 두뇌에 전극을 위치에 대 한 마이크로-CT 기반 방법

Lesion and electrode location verification are traditionally done via histological examination of stained brain slices, a time-consuming procedure that ...

Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred microliters of autologous blood was taken from the tail vein and stereotaxically injected into the pons. The injection process was divided into 2 steps: First, 10 &#181;L of blood was injected into a specific location, anteroposterior position (AP) -9.0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9.2 mm, followed by a second injection of the residual blood located at AP -9.0 mm; Lat 0 mm; Vert -9.0 mm with a 20-minute interval. The balance beam test, limb placement test, and the modified Voestch neuroscore were used to evaluate neurological function. Magnetic Resonance Imaging (MRI) was used to assess the volume of hemorrhage in vivo. The symptoms of this model were in line with patients with massive pontine hemorrhage.

We present a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat via dual injection of autologous blood.

자동 혈액의 이중 주입에 의한 대규모 폰틴 출혈

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred ...

Imaging and Quantification of Intact Neuronal Dendrites via CLARITY Tissue Clearing

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the morphology of processes and substructures within these neurons. As such, much of what is known about brain function has arisen alongside developments in imaging technologies that allow further insight into how neurons are organized and connected in the brain. Improvements in tissue clearing have allowed for high-resolution imaging of thick brain slices, facilitating morphological reconstruction and analyses of neuronal substructures, such as dendritic arbors and spines. In tandem, advances in image processing software provide methods of quickly analyzing large imaging datasets. This work presents a relatively rapid method of processing, visualizing, and analyzing thick slices of labeled neural tissue at high-resolution using CLARITY tissue clearing, confocal microscopy, and image analysis. This protocol will facilitate efforts toward understanding the connectivity patterns and neuronal morphologies that characterize healthy brains, and the changes in these characteristics that arise in diseased brain states.

Neuronal dendritic morphology often underlies function. Indeed, many disease processes that affect the development of neurons manifest with a morphological phenotype. This protocol describes a simple and powerful method for analyzing intact dendritic arbors and their associated spines.

선명도 조직 클리어링을 통한 손상되지 않은 뉴런 덴라이트의 이미징 및 정량화

Brain activity, the electrochemical signals passed between neurons, is determined by the connectivity patterns of neuronal networks, and from the ...

Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain cells and their interactions. Viral vector transduction enables the marking of diverse cell types in different fluorescence colors within the same tissue. Cells can be identified genetically by activity or projection. Using a modified CLARITY protocol, the potential sample size of astrocytes and neurons has grown by 2-3 orders of magnitude. The use of CLARITY allows the imaging of complete astrocytes, which are too large to fit in their entirety in slices, and the examination of the somata with all their processes. In addition, it provides the opportunity to investigate the spatial interaction between astrocytes and different neuronal cell types, namely, the number of pyramidal neurons in each astrocytic domain or the proximity between astrocytes and specific inhibitory neuron populations. This paper describes, in detail, how these methods are to be applied.

Combining viral vector transduction and brain clearing using the CLARITY method allows the investigation of a large number of neurons and astrocytes simultaneously.

맑은 뇌에서 성상세포와 뉴런 사이의 공간적 상호작용 조사

Combining viral vector transduction and tissue clearing using the CLARITY method makes it possible to simultaneously investigate several types of brain ...

Extraction and Tissue Clearing Preparation of Mouse Brain-Spinal Cord Samples

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, neuronal connectivity, and molecular dynamics. Traditional methodologies for investigating the entire brain and spinal cord often involve isolating, sectioning, and scanning tissue slices, followed by the labor-intensive process of three-dimensional image reconstruction. This conventional approach can be both time-consuming and cumbersome. Advancements in tissue clearing and whole-organ imaging techniques have revolutionized the analysis of the entire brain and spinal cord. To maximize the potential of these innovative methods, it is essential to extract and clear brain samples while maintaining their connection to the spinal cord. This protocol provides a detailed and systematic guide for preparing samples of the brain connected to the spinal cord, outlining the extraction and clearing procedures. By streamlining these processes, this approach significantly enhances experimental efficiency and data integrity, thereby fostering advancements in neuroscience research and enabling more comprehensive investigations into the complexities of the central nervous system.

This study presents a protocol for extracting and preparing cleared whole-brain and spinal cord samples with preserved fluorescent signals, enhancing experimental efficiency and data integrity to advance neuroscience research.

Extraction and Tissue Cleaning Preparation of Mouse Brain-Spinal Cord Samples(쥐의 뇌-척수 샘플의 추출 및 조직 세척 준비)

Neuroscience research focused on the central nervous system necessitates a thorough understanding of various factors, including cell distribution, ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for a Rat Brain Tissue Sample

<a href='https://app.jove.com/v/61821/a-hydrophobic-tissue-clearing-method-for-rat-brain-tissue'>Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).</a>This video demonstrates the method of hydrophobic tissue clearing of a rat brain tissue sample. The sample is sequentially dehydrated in methanol, treated with a dichloromethane and methanol mixture to dissolve lipids and pigments, and transferred to dibenzyl ether for complete tissue clearing, enabling detailed imaging without thin sectioning.

Source: Kirchner, K.N., et al.,&#160;A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue. J. Vis. Exp.&#160;(2020).This video demonstrates the ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Neurodegenerative Diseases

A Method for the Isolation of Neurovascular Units from Rat Brain

Source: Brzica, H., et al,. <a href="https://app.jove.com/v/57698">A simple and reproducible method to prepare membrane samples from freshly isolated rat brain microvessels.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the process of isolating brain microvessels from euthanized rats. It includes the dissection of the brain, cleaning of the tissue, and mechanical digestion, followed by repeated centrifugation to isolate the pure fraction of microvessels.

쥐의 뇌에서 신경혈관 단위를 분리하는 방법

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines. The procedural flow for the protocol ...