Ce protocole peut aider les chercheurs à séparer facilement les rétines des souris et à observer les changements dynamiques dans le système vasculaire rétinien du modèle murin OIR. Les principaux avantages de cette méthode sont la préservation de l’intégrité des rétines séparées et la possibilité pour chaque souris de servir de contrôle, ce qui rend les résultats plus comparables. Les chercheurs qui essaient cette méthode pour la première fois peuvent avoir du mal à prendre les cinq images d’orientation, car il est un peu difficile de placer les chiots dans la bonne position.
Pour recueillir le tissu pour le montage entier de la rétine, utilisez des ciseaux incurvés pour déconnecter les globes oculaires du tissu orbital d’un chiot C57-Black/6 euthanasié. Ensuite, insérez des pinces incurvées dans la partie postérieure du globe oculaire, en serrant le nerf optique et en soulevant rapidement l’œil de l’orbite. Placez les globes oculaires dans du PBS pré-refroidi pour enlever les poils et le sang de la surface.
Lorsque tous les globes oculaires ont été collectés, transférer les globes oculaires nettoyés dans un tube microcentrifuge de deux millilitres contenant 4% de paraformaldéhyde et incuber pendant 15 minutes à température ambiante et 12 à 15 tours par minute. À la fin de l’incubation, ajoutez une goutte de PBS au centre d’une boîte de culture sous un microscope à dissection et placez un globe oculaire dans la goutte. En tenant le globe oculaire avec une paire de forceps, utilisez une aiguille de seringue d’un millilitre pour percer soigneusement la cornée au niveau du limbe cornéen.
Insérez la pointe d’une paire de ciseaux dans la ponction et coupez la cornée le long du limbe cornéen, en prenant soin de ne pas couper la rétine. Utilisez une pince pour retirer l’iris et la lentille, et placez l’œilleton restant dans du paraformaldéhyde à 4% pour une incubation de 45 minutes à température ambiante sur le shaker. À la fin de l’incubation, placez l’œilleton fixe dans une goutte fraîche de PBS au centre d’un nouveau plat de culture.
En tenant l’œilleton avec une paire de pinces, utilisez une deuxième paire de forceps pour séparer doucement les couches de la rétine et de la sclérotique. Placez la pointe des ciseaux entre les couches de la rétine et de la sclérotique, et coupez la sclérotique vers le nerf optique. Décollez la sclérotique de la rétine pour obtenir la coupe rétinienne.
À l’aide d’une pince, relâchez la connexion entre les vaisseaux hyaloïdes radiaux et la rétine périphérique. Utilisez une pipette de deux millilitres avec l’embout coupé pour transférer la coupelle rétinienne dans un puits d’une assiette de 48 puits pour trois lavages de cinq minutes dans PBS à température ambiante sur le shaker. Après le dernier lavage, incuber la tasse dans 1% Triton X-100 et 5% de sérum d’âne normal dans PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Pour marquer le système vasculaire rétinien avec de l’isolectine B4, incuber la rétine dans un puits d’une plaque de 48 puits dans 400 microlitres de sérum d’âne normal à 0,1% supplémenté en isolectine B4-594 pendant une nuit à 4 degrés Celsius sur un shaker. Si nécessaire, un autre anticorps primaire peut être ajouté en même temps. Le lendemain, lavez la rétine avec trois lavages de 20 minutes à 0,1% PBST sur le shaker.
Après le dernier lavage, incuber la rétine avec un anticorps secondaire de haute affinité approprié pendant une heure à température ambiante avant de marquer l’échantillon avec DAPI pendant 20 à 25 minutes. À la fin de l’incubation, laver la rétine avec trois lavages de 30 minutes dans 0,1% PBST à température ambiante avec agitation. Après le dernier lavage, transférez la coupe rétinienne sur une lame propre avec l’ouverture vers le haut, et utilisez le microscope pour couper la rétine radialement aux positions trois, six, neuf et 12 heures de la périphérie vers le centre, jusqu’à un à 1,5 millimètre de la tête du nerf optique.
Rincez la rétine trois fois avec quelques gouttes de PBS par lavage avant d’utiliser du papier posé à l’air pour sécher et aplatir la rétine. Ajouter une goutte de support de montage au centre de la lamelle de couverture jusqu’à ce que le diamètre de la gouttelette couvre la moitié de la lamelle de couverture. Placez ensuite rapidement le couvercle de montage côté médium vers le bas sur la rétine étendue.
Une fois que tous les supports plats rétiniens ont été préparés, les échantillons peuvent être imagés par microscopie confocale à fluorescence. Pour l’imagerie in vivo, ajoutez 20 microlitres de gouttes ophtalmiques mydriatiques pour obtenir une dilatation durable de la pupille. Après cinq minutes, placez les chiots dans une position stable sur un petit coussin chauffant devant l’appareil d’imagerie.
Pour maintenir l’humidité dans les cornées, ajoutez régulièrement des larmes artificielles tout au long de la procédure d’imagerie. Ensuite, cliquez sur Imagerie du fond d’œil infrarouge sur l’appareil pour ajuster la tête du nerf optique au centre de l’écran. Injectez par voie intrapéritonéale 150 microlitres de solution de sel de sodium à 0,5% de fluorescéine et cliquez immédiatement sur les boutons FA et Injection sur l’écran tactile de l’appareil d’imagerie pour démarrer la minuterie.
Après trois minutes, lorsque la circulation sanguine de la rétine est entrée dans la phase veineuse, acquérir la première image de la rétine centrale. Déplacez la lentille de l’appareil d’imagerie horizontalement vers le côté nasal de l’œil jusqu’à ce que la tête du nerf optique soit située au milieu d’un côté de la zone d’acquisition d’image, puis prenez la deuxième image. Continuez à déplacer la lentille et à acquérir des images de la rétine temporale, supérieure et inférieure de la même manière.
Pour traiter les images rétiniennes dans un programme de traitement d’imagerie approprié, ouvrez le menu Fichier et cliquez sur Nouveau pour créer une nouvelle zone de dessin avec un arrière-plan noir. Ouvrez l’image de la rétine centrale. Cliquez ensuite sur Fichier pour ajouter une deuxième image.
Ajustez l’opacité de la deuxième image à 60% et déplacez et redimensionnez l’image jusqu’à ce que les deux images se chevauchent. Cliquez sur Basculer entre les modes de transformation libre et de déformation, et effectuez des ajustements subtils aux vaisseaux si nécessaire. Redéfinissez ensuite l’opacité de la deuxième image sur 100%Sélectionnez les deux images, puis cliquez sur Fusion automatique des calques.
Cochez Panorama comme méthode de fusion, puis cochez également les cases Tons et couleurs homogènes et Zones transparentes de remplissage sensibles au contenu. Cliquez sur OK pour terminer l’assemblage des deux premières images. Ensuite, ajoutez la troisième image et assemblez cette image aux deux premières images comme indiqué jusqu’à ce que les cinq images d’une seule rétine aient été assemblées.
Lorsque toutes les images de l’analyse ont été traitées, utilisez l’outil Recadrage pour recadrer les images FFA à une taille uniforme afin de faciliter l’observation des changements dans la dynamique vasculaire rétinienne à différents moments de développement. Après cinq jours d’exposition à l’hyperoxie, les rétines centrales des petits du jour 12 postnatal présentent une grande zone de non-perfusion. Lors du transfert à cinq jours de conditions hypoxiques, les rétines se néovascularisent progressivement, présentant une augmentation du signal de fluorescence plus forte que celle observée dans les vaisseaux normaux environnants.
Après le 17e jour postnatal, la néovascularisation pathologique régresse rapidement et la rétine présente un aspect tout à fait normal au 25e jour postnatal. Une bonne répétabilité et stabilité du modèle de rétinopathie induite par l’oxygène peut être obtenue en contrôlant la taille de la portée et le gain de poids postnatal des chiots. Comme observé, la vaso-oblitération culmine généralement au 12e jour postnatal et disparaît au 25e jour postnatal, tandis que la néovascularisation culmine au 17e jour postnatal et régresse au 25e jour postnatal.
Chez les souris rétinopathies induites par l’oxygène du jour 15 à 25 après la naissance, le diamètre des vaisseaux sanguins rétiniens augmente et devient très tortueux par rapport à celui observé pour la rétine des souris normales. Les forceps de la main gauche jouent principalement un rôle de soutien. Veillez à ne pas serrer le globe oculaire, ce qui peut le déformer ou le rompre.
