Le protocole consiste à normaliser la collecte de milieux de culture et l’analyse de la ploïdie chromosomique basée sur le criblage chromosomique non invasif NICS d’embryons humains préimplantatoires. Le principal avantage du NICS est la facilité d’utilisation plutôt que la micro-manipulation TiDieR, ce qui permet de gagner du temps et de réduire efficacement la perte d’échantillons de biopsie invasive. La méthode d’échantillonnage est très flexible.
Nous vous proposons ici deux options différentes, l’une pour la culture séquentielle d’embryons de routine et l’autre pour une étape. Ce sont les principaux collègues de notre équipe, le Dr Yaxin Yao et le Dr Xiaohui Zhu sont principalement responsables de la préparation de la bibliothèque et du séquençage de la régénération du NICS. Le Dr Jialin Jia et moi-même effectuons le travail d’embryologie et la collecte d’échantillons.
Le professeur Liu est le chef de notre groupe. Elle est également l’auteure correspondante de cet article. Pour commencer, préparez les réactifs et les outils.
Préchauffer et équilibrer 20 à 30 microlitres de milieu de culture et de hyaluronidase avant utilisation. Placez ensuite le milieu de culture et la hyaluronidase sur un plan de travail dans une hotte. Transférez rapidement les OCCC digérés dans la boîte de culture pour la manipulation des ovocytes et recouvrez d’huile minérale dans chaque puits.
Aspirez et libérez doucement les ovocytes cinq à 10 fois pour éliminer les cellules résiduelles de la granulosa autour des ovocytes. Répétez cette étape dans les trois puits restants pour éliminer complètement les cellules de la granulosa. Évaluez l’exhaustivité de l’élimination des cellules de la granulosa à l’aide d’un microscope.
Effectuez ensuite une injection intracytoplasmique de spermatozoïdes, également appelée ICSI, et transférez l’embryon dans le milieu de culture. Préparer 20 à 30 microlitres de microgouttelettes de milieu de culture de blastocyste pour chaque embryon. Couvrir les embryons d’huile minérale dans une boîte de culture tissulaire le deuxième jour et incuber à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 5 % d’oxygène.
Après avoir transféré l’embryon du troisième jour dans la microgouttelette de lavage, aspirez doucement et libérez l’embryon dans la microgouttelette dans les trois gouttelettes en série à l’aide des pipettes. Transférez ensuite l’embryon dans le milieu de culture du blastocyste. Préparez les microgouttelettes de lavage et les microgouttelettes de culture.
L’après-midi du quatrième jour, transférez l’embryon dans des microgouttelettes de milieu de culture préchauffées et lavez délicatement chaque embryon en série dans trois microgouttelettes avec les pipettes. Transférez chaque embryon dans une microgouttelette unique préchauffée de milieu de culture pour le prélèvement d’échantillons. Cultiver l’embryon de blastocyste avant cryoconservation.
Pour effectuer la vitrification avant la cryoconservation de l’embryon, préparer les microgouttelettes de culture et transférer l’embryon dans des microgouttelettes préchauffées de milieu de culture de 10 à 15 microlitres. Et lavez délicatement chaque embryon en série en trois microgouttelettes par pipetage le matin du cinquième jour. Comme nous l’avons déjà démontré, transférez chaque embryon dans une microgouttelette unique préchauffée de milieu de culture pour le prélèvement d’échantillons.
Et cultivez l’embryon de blastocyste à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone avant la cryo-conservation. Ensuite, ajustez doucement l’ICM à une distance considérable du point ciblé du faisceau laser qui se concentre sur la jonction cellulaire du trophectoderme pour générer un petit trou dans le trophectoderme afin de libérer le fluide de la cavité du blastocèle. Pour prélever l’échantillon, décongelez le tampon dans le kit à température ambiante et centrifugez brièvement.
Transférez ensuite le milieu de culture de chaque embryon cultivé dans un tube PCR sans RNase-DNase contenant cinq microlitres de tampon de lyse cellulaire. Préparez les réactifs et les outils. Après quantification de l’ADN génomique dilué à une concentration de 50 picogrammes par microlitre avec le milieu de culture.
Après avoir bien mélangé, centrifugez brièvement le tube à 200 G pendant cinq secondes. Après avoir centrifugé le milieu de culture dans une microcentrifugeuse pendant 30 à 60 secondes, pipetez 10 microlitres de milieu de culture du fond du tube de contrôle positif dilué et du milieu de culture frais dans un nouveau tube PCR de 0,2 millilitre. Ajouter un microlitre de mélange enzymatique MT et bien mélanger par pipetage.
Ensuite, centrifugez immédiatement pendant deux à trois secondes. Placez le tube PCR dans une station de préparation d’échantillons mélangés préchauffés et exécutez le programme de lyse. Une fois que le tampon de pré-bibliothèque est décongelé et mélangé, centrifugez-le immédiatement pendant deux à trois secondes à 200 G.Préparez un mélange maître pour la réaction de pré-bibliothèque en ajoutant deux microlitres de mélange enzymatique de pré-bibliothèque à 60 microlitres de tampon de pré-bibliothèque.
Mélangez bien la réaction et centrifugez brièvement. Ajouter 60 microlitres de mélange réactionnel pré-bibliothèque dans l’échantillon de milieu prétraité. Après avoir bien mélangé par pipetage, centrifuger immédiatement pendant deux à trois secondes à 200 G.Placez le tube PCR dans la station de préparation d’échantillons préchauffée.
Exécutez le programme de pré-bibliothèque et maintenez à quatre degrés Celsius. Préparez un mélange maître pour la réaction de la bibliothèque en ajoutant 1,6 microlitre de mélange enzymatique de la bibliothèque à 60 microlitres de tampon de bibliothèque. Mélangez bien la réaction et centrifugez comme indiqué précédemment.
Ajoutez 60 microlitres du mélange réactionnel de la bibliothèque et deux microlitres de l’apprêt pour codes-barres à chaque produit de pré-bibliothèque. Ensuite, mélangez bien la réaction et centrifugez comme démontré. Après la centrifugation, placez le tube PCR dans le thermocycleur.
Exécutez le programme de préparation de la bibliothèque, puis maintenez à quatre degrés Celsius. Préparez les réactifs et les outils. Ajoutez les méga perles préparées 1X préparées à l’échantillon de la bibliothèque.
Quantifier les bibliothèques purifiées comme décrit dans le manuscrit de texte et utiliser 10 nanogrammes de chaque échantillon de bibliothèque pour la mise en commun. Reportez-vous au guide de l’utilisateur du séquençage et effectuez l’analyse des données une fois le séquençage terminé. Saisissez le nom et le mot de passe de l’utilisateur sur la page de connexion pour l’analyse des données dans ChromGo.
Une fois connecté, cliquez sur Créer une soumission sous l’onglet NICS. Choisissez ensuite NGS pour la plate-forme, Illumina pour les entreprises et NICSInst pour le réactif. Entrez les informations du projet dans la zone située sous ID de projet.Définissez les préférences d’analyse et téléchargez les fichiers.
Une fois que tous les fichiers de séquençage ont été téléchargés avec succès, cliquez sur Envoyer pour démarrer l’analyse. Les projets soumis sont répertoriés sous l’onglet Afficher les soumissions. Cliquez sur le bouton Afficher dans le champ Rapport pour afficher le tableau récapitulatif de l’analyse NICS.
Cliquez sur le bouton Exporter le rapport pour enregistrer les rapports. Six blastocystes ont été prélevés sur des patients et un NICS a été réalisé sur les six embryons du quatrième au cinquième jour. Les anomalies chromosomiques causées par la translocation équilibrée des parents ont été détectées dans cinq des chromosomes à l’aide du test NICS et, par conséquent, elles n’ont pas été utilisées pour le transfert.
Les résultats NICS des deux embryons ont montré le même caryotype 45 XN et la délétion du chromosome 18 étaient toutes deux des délétions du chromosome 18. Le bras court du caryotype 46 XN de la délétion de la région chromosomique un n’était que le bras court de la délétion de la région chromosomique. Les résultats du NICS ont montré un caryotype 46 XN avec le bras long de la délétion de la région du chromosome 18 et le bras court de la duplication de la région du chromosome 1.
Bien que les caryotypes aient été des duplications du chromosome cinq et aient montré huit différences de mosaïque, le test NICS a pu dépister l’aneuploïdie des 24 chromosomes. Ce procédé fournit une nouvelle méthode de transfert de blastocystes de caryotype normal unique. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’éliminer complètement les cellules cumulaires pour éviter la contamination d’origine maternelle et de collecter le milieu de culture et le stade de blastocyste exposé lorsque le contenu en ADN est suffisant pour l’amplification.
En utilisant la technologie NICS, la présente étude a rationalisé les étapes de préparation de la bibliothèque WGA et WGS en environ trois heures et le résultat de la SCC optée de manière non invasive en environ neuf heures. Après son développement, la technique a fourni aux cliniciens de l’ART une nouvelle façon de combiner l’évaluation morphologique avec le NICS pour transférer l’embryon d’aploïdie avec une bonne morphologie dans l’utérus pourrait améliorer les taux de grossesse en cours et les taux de naissances vivantes.
