Le protocole que nous présentons ici est un semi-conducteur rapide et peu coûteux, des méthodes basées sur le séquençage pour le dépistage de l’aneuploïde chez les embryons. Le protocole raffiné pour l’amplification des modèles d’exécution, et les arrangements de la bibliothèque de séquençage rend la détection PGTA reproductible, débit élevé, rentable et gain de temps. Le temps d’exécution de ce séquenceur semi-conducteur n’est que de deux à quatre heures.
Raccourcir le délai d’exécution entre la réception d’échantillons et la publication de rapports en cinq jours. Cette méthode fournit le séquençage du génome pour le criblage de l’aneuploïde, la variation du nombre de copies et les appels de polymorphisme nucléotide unique. En raison de la chimie de séquençage différente, la bibliothèque préparée par ce protocole ne peut pas être séquencée directement sur d’autres systèmes de séquençage.
Mais le même séquenceur, mais la préparation différente de bibliothèque, il est capable de faire le criblage prénatal non invasif. Xiangchun Guo, technicien de notre laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer le séquençage, vortex chaque bibliothèque diluée et tourner brièvement quatre fois sur la mini centrifugeuse pendant trois secondes à chaque fois.
Ensuite, prenez cinq microlitres de chaque bibliothèque, pour mettre en commun dans le noyau libre, un point de cinq millilitres tube. Vortex de la bibliothèque mixte et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant trois secondes. Ajouter 150 microlitres de la solution de rupture, à deux nouveaux tubes de récupération.
Installez les nouveaux tubes de récupération, le routeur de récupération et la plaque d’amplification. Mélanger en inversant la bouteille d’huile trois fois. Assurez-vous que la solution d’huile et de récupération est au moins les deux tiers complète.
Vortex le tampon PCR mix maître pendant 30 secondes et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant trois secondes. Vortex les particules de sphère et la bibliothèque mixte pendant une minute et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant trois secondes. Ensuite, préparez un mélange de ligature de 2400 microlitres, en ajoutant 172 microlitres d’eau sans nucléase, huit microlitres de la bibliothèque mixte, 120 microlitres du mélange d’enzymes, et 100 microlitres des particules de sphère, au tube contenant 2000 microlitres du tampon PCR de mélange principal.
Réglez une pipette sur 800 microlitres et chargez le mélange de ligature au filtre de réaction à travers le port de l’échantillon. Inverser la bouteille d’huile trois fois et utiliser une pipette P1000 pour ajouter 200 microlitres de l’huile de réaction au filtre de réaction. Sélectionnez le programme Proton, puis sélectionnez le bouton assisté, pour vous assurer que l’appareil a été correctement mis en place, en suivant les instructions sur le moniteur.
Cliquez ensuite sur Suivant pour démarrer le programme. Chargez 100 microlitres de l’échantillon de produit PCR émulsion, 130 microlitres des perles lavées, 300 microlitres de la solution de lavage ES, et 300 microlitres de la solution de fusion dans la bande de huit tubes. Placez la bande de huit tubes sur le système d’enrichissement.
Installez une pointe pipette et un nouveau tube à zéro point deux millilitres et démarrez le programme. Centrifugeuse le tube à zéro point deux millilitres à 15 500 fois G pendant cinq minutes. Jetez le surnatant et conservez dix microlitres du produit d’enrichissement.
Ajouter 200 microlitres d’eau sans nucléase au tube et mélanger par vortex. Centrifugez à nouveau le tube de deux millilitres à zéro point. Jetez le supernatant et gardez 10 microlitres du produit d’enrichissement.
Ajouter 90 microlitres d’eau sans nucléase au tube et mélanger par vortex. Pour préparer le modèle, vortex le contrôle positif et tourner brièvement. Ajouter cinq microlitres du contrôle positif à 100 microlitres du produit d’enrichissement.
Vortex et centrifugeuse à 15 500 fois G pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et gardez 10 microlitres du modèle. Ensuite, ajoutez 20 microlitres de l’amorce de séquençage, et 15 microlitres du tampon annealing au tube de modèle.
Vortex le tube et tourner brièvement sur une mini centrifugeuse pendant trois secondes. Incuber le tube dans un cycleur thermique avec un couvercle chauffant. Ajouter ensuite 10 microlitres du tampon de chargement au tube.
Mélanger en pipetant de haut en bas. Mélanger les 55 microlitres d’échantillon en pipetage de haut en bas et charger l’échantillon au puits de chargement de la puce. Gardez la pointe de pipette utilisée et le tube PCR à zéro point deux millilitres.
Placez la puce sur la mini centrifugeuse à puce lorsqu’un échantillon entre dans la puce. Vérifiez la position et centrifuger la puce pendant 10 minutes. Préparez un tampon de 50 % en ajoutant 500 microlitres de tampon annealing et 500 microlitres d’eau sans nucléase dans un tube d’un point de cinq millilitres.
Préparer la solution de rinçage, en ajoutant 500 microlitres de tampon annealing et 500 microlitres de 100%2-propanol dans un tube d’un point de cinq millilitres. Ensuite, préparer le mélange moussant, en ajoutant 49 microlitres de la mémoire tampon annealing 50% et un microlitre de la solution moussante à deux nouveaux tubes d’un point cinq millilitres. Pipette air dans l’un des mélanges moussants, et charger 120 microlitres des bulles dans le puits de chargement.
Transférer le liquide expulsé excessif de la sortie jusqu’au puits de chargement et centrifuger la puce pendant 30 secondes sur la mini centrifugeuse à copeaux. Répétez le processus pour le deuxième mélange moussant. Ajouter 55 microlitres du tampon de 50% annealing au tube maintenu à zéro point deux millilitres.
Utilisez la pointe de pipette conservée pour pipette de haut en bas. Chargez les 55 microlitres du tampon annealing jusqu’au puits de chargement. Centrifuger la puce pendant 30 secondes sur la mini centrifugeuse à puce désignée.
Chargez 100 microlitres de la solution de rinçage dans le puits de chargement des copeaux et jetez le liquide expulsé du puits de sortie. Répétez cette étape de chargement une fois. Chargez 100 microlitres du tampon de 50% annealing, dans le puits de chargement des copeaux.
Répétez cette étape de chargement pour un total de trois fois. Ajouter 60 microlitres du tampon de 50% annealing et six microlitres de l’enzyme de séquençage dans un nouveau tube de cinq millilitres d’un point. Mélanger en pipetant de haut en bas.
Lentement pipette 65 microlitres de cette solution mixte dans le puits de chargement des copeaux, en évitant les bulles. Gardez la puce à l’écart de la lumière et incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Enfin, après l’incubation, chargez immédiatement la puce sur le séquenceur et cliquez sur Démarrer la course de séquençage sur l’écran pour commencer le séquençage.
Une analyse statistique rétrospective sur 186 stades de clivage et 1135 embryons de stade blastocyste a donné lieu à des taux de réussite de plus de 95 % dans les deux types d’échantillons. Les taux de défaillance du contrôle de la qualité du séquençage étaient de 3,4 % dans le groupe d’étape de clivage et de seulement 1,9 % dans le groupe d’étape blastocyste. Outre l’aneuploïde, les données de séquençage peuvent être utilisées pour d’autres analyses.
Par exemple, les variations de numéro de copie avec une taille inférieure à cinq mégabases, ou l’analyse de l’ADN mycondrial, selon la profondeur et la qualité du séquençage. Avec l’amélioration de l’appel de numéro de copie, les chercheurs peuvent étudier davantage l’avenir du mosaicism chromosomique dans les embryons humains de stade précoce.
