Ce protocole peut être utilisé pour étudier le processus par lequel un plus large éventail de protéines précurseurs séparées, y compris les membres de la famille TGF-bêta, sont converties en protéines actives après un clivage protéolytique. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit des méthodes très rapides et peu coûteuses pour obtenir un produit de clivage TGF-bêta hautement concentré in vivo dans des conditions visualisées. Pour commencer, après l’injection le lendemain, retirez la solution de Ficoll et tous les embryons morts ou mourants, puis rincez les embryons une ou deux fois avec MBS et culturez les embryons dans MBS sur le banc à température ambiante ou à 16 degrés Celsius dans l’incubateur pour ralentir le développement.
Chauffez et tirez les capillaires en verre jusqu’à un point fin à l’aide d’un arracheur de micropipette avec les réglages souhaités. À l’aide d’une pince, coupez la pointe d’une aiguille tirée. Pour éviter le colmatage, l’ouverture de l’aiguille d’aspiration de la blastocèle doit être plus grande que l’aiguille de micro-injection.
Insérez l’aiguille d’aspiration dans le porte-aiguille relié au micro-injecteur et fixez le porte-aiguille au micromanipulateur. Placer les embryons au stade de gastrula précoce à moyen dans un plateau d’injection ou un plat rempli de MBS. Insérez l’aiguille sous la surface de l’embryon près du pôle animal.
Appuyez sur le bouton de remplissage du micro-injecteur tout en observant l’aiguille et l’embryon à travers un microscope à dissection. En quelques secondes, le niveau de liquide clair augmente dans l’aiguille et l’embryon s’effondre et devient concave. Pulsez le bouton d’injection une ou plusieurs fois pour éjecter toute substance blanche trouble entrant dans l’aiguille contenant des débris ou des protéases.
Pour détecter les produits de clivage sur les immunoblots, aspirer le liquide blastocèle de 10 à 20 embryons ou plus selon les anticorps. Pipette un microlitre d’eau sans noyau sur un morceau de paraffine placé sur le plateau d’injection. Immergez l’aiguille dans la goutte d’eau et appuyez sur le bouton d’injection pour dissiper le liquide blastocèle dans l’eau.
Alternativement, pour éjecter le fluide directement sur le parafilm et l’empêcher de s’aplatir, actionnez le bouton d’injection pour expulser le fluide sous une pression plus basse. Transférer le fluide blastocèle récolté dans un tube de microcentrifugation stérile sur de la glace et ajouter de l’eau sans noyau pour ajuster le volume final à 30 microlitres. Pour détecter les protéines précurseurs du TGF-bêta, transférez les embryons appauvris en liquide blastocèle dans un tube séparé sur de la glace.
Enlevez l’excès de MBS et ajoutez 200 microlitres de tampon de lysate d’embryon pré-réfrigéré. Pour homogénéiser complètement les embryons, pipettez de haut en bas 10 à 20 fois jusqu’à ce qu’il ne reste plus de touffes. Centrifuger les embryons homogénéisés dans une microcentrifugeuse réfrigérée à 10 000 fois G pendant 10 minutes, puis retirer 160 microlitres du surnageant à l’aide d’une pipette P200 et transférer dans un nouveau tube sur glace, en prenant soin d’éviter les protéines de jaune blanc et autres débris cellulaires dans la moitié inférieure du tube.
Répétez la microcentrifugation une fois et transférez 128 microlitres du surnageant clair dans un nouveau tube sur glace. À ce stade, les lysates embryonnaires éliminés et le liquide blastocèle collecté peuvent être stockés à moins 80 degrés Celsius aussi longtemps que vous le souhaitez. Déglycosyler les protéines clivées présentes dans le liquide blastocèle modifié par le réseau trans-Golgi avec PNGase F en suivant les instructions du fabricant.
Les produits déglycosylés migreraient sous forme de bande plus condensée sur les gels SDS, ce qui peut aider à une identification précise. Pour évaluer les monomères de fragments de prodomaine et les protéines dépliées dans le blastocèle et le lysate, analysez les protéines dans des conditions de réduction en ajoutant cinq microlitres de tampon d’échantillon réducteur 4X à 15 microlitres de liquide blastocèle et 15 microlitres de lysate d’embryon clarifié. Pour évaluer la formation de ligands homodimériques ou hétérodimériques clivés dans le blastocèle, analysez les protéines dans des conditions non réductrices en ajoutant cinq microlitres de tampon d’échantillon 4X non réducteur aux 15 microlitres restants de liquide blastocèle, puis chauffez-le pendant cinq minutes et placez-le sur de la glace.
Après avoir utilisé ce protocole, les protéines ont été séparées par SDS-PAGE et les immunoblots ont été sondés avec des anticorps qui reconnaissaient la balise d’épitope myc. Dans les conditions réductrices, dans les lysates d’embryons n’exprimant que Bmp4 ou Bmp7, une seule bande correspondant à des monomères Bmp4 clivés et une bande de migration plus lente correspondant à des monomères Bmp7 clivés ont été détectées. Les deux bandes ont été détectées chez des embryons co-exprimant Bmp4 et Bmp7.
Lorsque les protéines ont été séparées dans des conditions non réductrices, une seule bande hétérodimère mature Bmp4 et 7 de mobilité intermédiaire a été détectée ainsi qu’une trace d’homodimère Bmp4 dans les embryons co-exprimant Bmp4 et Bmp7. La formation d’hétérodimères Bmp4 et Bmp7 a également été observée lorsque les niveaux de protéines Bmp7 étaient élevés. Cependant, dans ce cas, l’excès de Bmp7 a formé des homodimères et des embryons co-exprimés Bmp4 et Bmp7.
Ces résultats ont démontré que Bmp4 et 7 forment préférentiellement des hétérodimères lorsqu’ils sont co-exprimés dans des embryons de Xenopus laevis. Dans cette expérience, la collecte de blastocèle pur est l’étape la plus importante qui nécessite une expérience précise de la manipulation des aiguilles. Alors continuez simplement à essayer et à corriger les erreurs.
Cette procédure teste si les hétérodimères BMP se forment et quels acides aminés sont importants pour cela. L’étape suivante, la souris knockin peut être générée pour demander si ces acides aminés sont fonctionnellement importants pendant le développement des mammifères.
