La technologie actuelle permet l’utilisation d’anticorps élevés chez la même espèce pour détecter jusqu’à sept marqueurs. Loucia Chan, une technicienne du laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Commencez par préparer les lames de verre en paraffine fixées au formol montées avec l’échantillon de tissu, en plaçant les lames à plat dans un four, pour cuire à 60 degrés Celsius avec le tissu tourné vers le haut.
Après une heure, décirez et réhydratez les lames toutes les 10 minutes chacune avec la série de produits chimiques, comme décrit dans le manuscrit. Immergez les lames dans une solution saline tamponnée tris, puis dans une boîte à lames en plastique remplie d’un mélange de formaldéhyde dilué dans du méthanol, pour fixer les échantillons. Ensuite, lavez les lames deux fois dans de l’eau désionisée pendant deux minutes.
Procéder à la récupération de l’épitope, en plaçant le rack de lames dans une boîte de résistance à la chaleur remplie de tampon d’acide citrique à pH 6,0. Et puis placer la boîte au micro-ondes, pour chauffer les lames d’abord à 100% de puissance pendant 50 secondes, puis 20 minutes à 20% de puissance, pour maintenir la même température. Après avoir rincé les lames à l’eau distillée et les avoir lavées avec tbST, immergez la lame dans un bocal contenant une solution bloquant la peroxydation pendant 10 minutes.
Après l’incubation, rincez les lames à l’eau distillée et lavez-les avec tbST, puis utilisez un stylo barrière hydrophobe pour marquer une limite autour de la section tissulaire sur la lame. Rincez ensuite la lame dans TBST, couvrez les sections de tissu avec le tampon bloquant et incubez les lames dans une chambre humidifiée pendant 15 minutes. Pour éliminer les réactifs bloquants, incuber d’abord les lames avec l’anticorps primaire d’intérêt, puis retirer l’anticorps primaire en lavant les lames trois fois avec tbST, avant l’incubation avec l’anticorps secondaire marqué à la peroxydase de raifort polymère.
Après l’incubation, lavez les lames avant d’appliquer la flore opale pour la solution de travail TSA, puis rincez la lame avec le tampon de récupération de l’antigène. Effectuez le décapage à base de micro-ondes en chauffant les lames dans un tampon de récupération d’antigène dans un micro-ondes à 100% de puissance, pendant 50 secondes, suivi de 20% de puissance pendant 20 minutes dans les récipients de sécurité au micro-ondes. Après avoir refroidi les échantillons à température ambiante pendant 15 minutes, rincer les lames à l’eau distillée et au TBST, puis incuber avec une solution de soupe pendant cinq minutes.
Ensuite, séchez la glissière à l’air libre avant de la monter avec le support de montage approprié. Avant l’imagerie des diapositives, préréglez les filtres appropriés dans le poste de travail. Capturez un minimum de 10 champs pour une analyse inférieure à un grossissement de 200 fois.
Pour compter les cellules, cliquez sur le bouton Compter les objets dans la barre d’étapes, pour afficher le panneau des paramètres de comptage d’objets. Si le tissu a été segmenté, sélectionnez la catégorie de tissu dans laquelle les objets se trouvent. Sélectionnez ensuite la mise à l’échelle de signal souhaitée à partir de l’échelle automatique ou de l’échelle fixe.
Pour la segmentation des objets, sélectionnez le composant principal dans la liste déroulante. Pour détecter les objets touchant d’autres objets en tant qu’objets individuels et non combinés, cochez la case taille maximale et pixels, puis optez pour le fractionnement affiné. Ensuite, comptez toutes les cellules stromales dans les cellules immunitaires séparément, pour exprimer les données en pourcentage des cellules immunitaires par rapport au nombre total de cellules stromales pour chaque image capturée.
Plus tard, indiquez le nombre final de cellules comme une moyenne de tous les champs. À l’aide de l’éditeur de vues, examinez le post-traitement des tables de données résultantes, puis exportez la table de données de comptage. Dans l’analyse représentative, quatre types de cellules immunitaires dans l’échantillon d’endomètre sont différenciés.
L’image traitée montre la segmentation des tissus sous forme de compartiments épithéliaux et stromaux. L’immunocoloration multiplex a été réalisée sur les biopsies de l’endomètre d’une femme témoin fertile et d’une femme présentant une fausse couche récurrente inexpliquée, un seul étage pour nous représentant CD3, CD56, CD68 et CD20 ont été révélés dans l’immunocoloration. Une fois que le son immunitaire a été identifié, une coloration supplémentaire sous la cytokine peut aider à traiter leur interaction et leur mécanisme de réussite de l’implantation.
