Cette procédure est très sensible et permet une visualisation de plusieurs transcriptions avec un minimum d’arrière-plan. Cette méthode permet de générer des cartes précises du profil transcriptionnel de types cellulaires très hétérogènes. La démonstration de la procédure sera faite par moi et Johnson Bob-manuel, un technicien de recherche au laboratoire.
Commencez par collecter toute la masse ganglionnaire vagale de la souris âgée de huit semaines de chaque côté, à l’aide d’une lunette de dissection et d’instruments chirurgicaux. Après la décapitation de la souris, utilisez une petite pince pour enlever les muscles sternohyoïdes et omohyoïdes latéralement à la trachée pour exposer l’os occipital. Nettoyez toute la région des muscles et des tissus jusqu’à ce que l’artère carotide, le nerf vague et hypoglosse et le foramen magnum soient visibles.
Ensuite, coupez tout le nerf hypoglosse avec de petits ciseaux à ressort. Localiser pour le ganglion nodosé comme une masse translucide près du foramen magnum. À l’aide de petits ciseaux, cassez soigneusement l’os occipital.
Pour exposer davantage le ganglion jugulaire, localisez les mélanocytes noirs à la surface de la jugulaire comme point de repère visuel. Lorsque les ganglions sont trouvés, coupez les attaches nerveuses entre la masse ganglionnaire vagale et tirez doucement sur l’extrémité périphérique du nerf vague tout en coupant simultanément le ganglion jugulaire vers le tronc cérébral avec de petits ciseaux à ressort pour l’extraction de toute la masse ganglionnaire. Enlevez le tissu conjonctif, la masse ganglionnaire et la graisse qui adhèrent au nerf vague.
Garder environ un demi-centimètre du nerf vague pour faciliter la manipulation et la localisation des échantillons. Placez le retrait sur les ganglions à l’aide de pinces fines dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 millimètre. Et incuber à quatre degrés Celsius dans le formol pendant 24 heures.
Et puis avec 30% de saccharose pendant 24 heures. Après l’incubation, placez les ganglions à l’intérieur d’une goutte de quatre millimètres de diamètre de milieu de température de coupe optimale sur un morceau de papier d’aluminium. Et formulez l’échantillon sur un lit de glace carbonique.
Coupez les échantillons congelés avec un cryostat en sections de 14 micromètres d’épaisseur à moins 20 degrés Celsius et collectez les sections coupées sur les lames de microscope en verre à trois séries espacées de 42 micromètres. Rincez les lames avec des coupes de tissu dans PBS. Et cuire au four pendant 30 minutes à 60 degrés Celsius dans un four à pâtisserie.
Ensuite, postfixez les lames dans du formol à 4% pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius. Déshydratez en série les lames dans 50% 70% et 100% d’éthanol pendant cinq minutes chacune. Et appliquer une solution de peroxyde d’hydrogène sur les échantillons pendant 10 minutes avant de rincer dans de l’eau distillée double.
Pour l’hybridation in situ, ou ISH, traiter les échantillons avec le réactif de récupération cible pendant cinq minutes. Ensuite, rincez séquentiellement les échantillons dans de l’eau distillée double et de l’éthanol à 100%, puis séchez à l’air. À l’aide d’un stylo hydrophobe, créez une barrière autour des échantillons.
Pendant que les échantillons sont traités avec de la protéase pendant 30 minutes à 40 degrés Celsius et un four d’hybridation, préchauffer les sondes à 40 degrés Celsius et les refroidir à température ambiante avant utilisation. Après être sorti du four, incuber les lames avec la combinaison souhaitée de sondes cibles pendant deux heures à 40 degrés Celsius dans un four d’hybridation. Incuber le tissu témoin négatif avec la dihydrodipicolinate réductase ou DapB, sonde cible C1 pendant deux heures à 40 degrés Celsius.
Rincez les lames dans un tampon de lavage et conservez-les dans cinq fois le citrate de sodium salin à température ambiante pendant la nuit. Le lendemain, rincez les lames avec un tampon de lavage avant l’incubation avec des réactifs d’amplification. Et traitez avec des réactifs spécifiques au canal comme décrit dans le manuscrit.
Lavez les lames suivies d’un traitement avec DapB pendant 30 secondes. Ensuite, appliquez immédiatement le support de montage sur chaque glissière et placez un glissement de couverture sur la section de tissu. Gardez les tissus horizontaux dans un porte-lames à quatre degrés Celsius jusqu’à l’imagerie.
Préparez un microscope confocal pour l’imagerie en définissant les paramètres requis. Acquérir les images avec une moyenne de ligne de quatre et une taille de pixel d’au moins 1024 par 1024 pour améliorer la qualité des images. Une fois satisfait des paramètres d’acquisition, commencez à acquérir les images en utilisant les mêmes paramètres.
Attribuez de fausses couleurs à chaque canal pour faciliter la visualisation. À l’aide des images numériques, effectuez le comptage cellulaire en identifiant le contour des profils positifs de portée de l’ARN avec un noyau légèrement coloré avec DapB. Calculez le pourcentage de profils positifs de portée de l’ARN exprimant chaque transcription.
Les paramètres d’acquisition optimaux ont été choisis pour chaque laser en fonction de la fluorescence non spécifique obtenue dans le tissu témoin négatif. La fluorescence endogène dans le ganglion de nodose d’une souris jeune adulte est minime. Et l’incubation avec une sonde DapB, cela n’a pas donné de signaux.
À une puissance accrue du laser et du gain avec le laser de 488 nanomètres, un arrière-plan indésirable et des points fluorescents aléatoires apparaissent. La technique de portée de l’ARN a été appliquée pour détecter trois gènes dans des sections tissulaires de la masse ganglionnaire vagale. Le profil tissulaire était positif pour le GHSR et le CCK1R.
Le profil comprenait à la fois des transcriptions Phox2b et CCK1R dans la partie rostrale du ganglion nodosé. À la suite de l’ISH multiplex dans les neurones afférents nodosés, les signaux Phox2b se sont spécifiquement accumulés dans les neurones afférents, situés dans le ganglion nodose. Les signaux CCK1R ont intensément marqué de nombreux neurones dans le ganglion nodosé.
À faible grossissement, les cellules exprimant de faibles signaux CCK1R ou GSHR ne pouvaient pas être observées facilement. DapB a aidé à visualiser le tissu et à identifier les neurones afférents vagals avec un noyau grand et légèrement coloré. À fort grossissement, les profils positifs de Phox2b sont évidents.
Les profils deux et trois sont des cellules Phox2b avec des signaux CCK1R élevés et modérés. Le profil quatre exprimait à la fois le GHSR et le CCK1R. En raison de l’ISH multiplex des neurones afférents jugulaires, le transcrit PRDM12 a pu être vu spécifiquement accumulé dans les neurones afférents situés dans le ganglion jugulaire.
À fort grossissement, des signaux modérés pour CCK1R ont été détectés dans les profils un et deux. Le profil trois est un représentant des cellules PRDM12 négatives pour CCK1R ou GHSR. La cohérence de la dissection est un facteur important.
Il est tout aussi important de vérifier que les paramètres d’acquisition d’imagerie ne génèrent pas de signaux d’arrière-plan indésirables. L’hybridation multiplex in situ est devenue la référence en matière moléculaire établie, en particulier dans le domaine de la neuroanatomie. Cette méthode peut être facilement combinée avec l’immunohistochimie.
