Notre protocole peut être utilisé pour étudier la motilité et la localisation des organites ou des protéines astrocytiques dans des environnements extracellulaires contrôlés et des états de maladies bénignes. Contrairement aux préparations fixes MHA, qui fournissent des instantanés simples de la localisation des protéines et des organelles, notre technique d’imagerie en direct peut être utilisée pour analyser la dynamique des particules chez les astrocytes vivants individuels. La veille des astrocytes de graines de transfection à la densité appropriée pour l’imagerie à 24 à 48 heures après transfection.
Diluer le reagent de lipofection dans le milieu réduit de sérum à la concentration expérimentale appropriée. Diluer cinq microgrammes d’ADN de haute pureté dans 250 microlitres de sérum réduit moyen et ajouter cinq microlitres de réamétrage exhausteur de lipofection au tube. Mélanger le réaccente de lipofection avec un volume égal du mélange exhausteur de lipofection d’ADN et incuber la solution pendant 15 minutes à température ambiante.
À la fin de l’incubation, retirer le supernatant de la culture des astrocytes et ajouter 100 microlitres du mélange de transfection dropwise aux cellules. Après six heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, remplacer le complexe de transfection par un volume approprié de milieu de culture des astrocytes et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pour un supplément de 24 à 72 heures. 30 minutes avant l’imagerie, diluer une sonde d’étiquetage lysosomal appropriée dans 200 microlitres de milieu de culture des astrocytes à une concentration de travail d’un micromolaire et étiqueter les astrocytes avec une sonde pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Lavez ensuite les cellules une fois avec le milieu chaud de culture d’astrocyte et remplacez le lavage par le milieu d’imagerie. Immédiatement après l’étiquetage de la sonde, placez le récipient de culture des astrocytes dans l’adaptateur approprié au stade du microscope et à l’aide de la lumière de fluorescence EBI, localisez les cellules qui expriment des protéines fluorescentes ou sondent. Utilisez l’appareil photo numérique pour ajuster l’éclairage de l’échantillon fluorescent pour visualiser les cellules sélectionnées et ajuster la mise au point et zoomer sur une seule cellule.
Utilisez ensuite les fonctions Zoom et Definite Focus pour acquérir une seule série z-stack time-lapse à une fréquence d’un cadre toutes les deux secondes pour des intervalles de temps allant de 300 à 500 secondes. Enregistrez et exportez les images en time-lapse sous forme de fichiers piles AVI ou TIFF. Pour analyser les images time-lapse, ouvrez la séquence d’image time-lapse dans ImageJ ou Fidji et utilisez l’outil Split Channel pour diviser les canaux.
Dans l’image du canal vert huit bits, utilisez l’outil Segmenté Line pour tracer une ligne le long des trajectoires des particules en utilisant la même convention directionnelle souhaitée pour tous les films afin que la polarité soit cohérente à l’intérieur et à travers toutes les cellules étudiées. Double cliquez sur l’outil Ligne pour ajuster la largeur de la ligne pour correspondre à l’épaisseur de la piste et exécuter la macro Draw Kymo du plugin Kymo ToolBox en utilisant une largeur de ligne de 10. Une invite demandant de calibrer l’image dans le temps et l’espace apparaîtra.
Une fois calibrés, les kymographes seront générés et peuvent être enregistrés sous forme de fichiers TIFF. Pour assigner des trajectoires de particules, utilisez l’outil Segmenté Line pour suivre manuellement chaque particule dans le kymograph pendant toute la durée de l’acquisition et utilisez le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer chaque trajectoire de particule comme région d’intérêt. Enregistrez toutes les régions d’intérêt par chaque vidéo time-lapse pour une analyse plus approfondie et exécutez la macro Analyze Kymo du plugin Kymo ToolBox.
Une fenêtre s’ouvrira demandant de définir la direction extérieure du mouvement des particules à partir du noyau de la cellule d’intérêt du menu dropdown. La vitesse limite doit être définie en fonction de la sensibilité du logiciel pour chaque cargaison d’intérêt et la largeur de la ligne doit être ajustée pour correspondre à l’épaisseur de chaque trajectoire de particule. Le journal toutes les données et les coordonnées extrapolées journal devrait être pour le calcul des différents paramètres de transport de fret.
Cliquez sur Ok. Les données calculées pour les pistes individuelles seront ensuite mis en commun par kymograph et enregistrées dans des fichiers texte spécifiques à chaque image. La combinaison du traitement de cytosine arabinoside avec la stratégie de purification basée sur la secousse enrichit la pureté des cultures d’astrocytes par rapport aux protocoles traditionnels qui incluent l’étape de purification seulement.
La transfection basée sur la lipoféction permet l’expression transitoire de protéines à des niveaux optimaux pour l’imagerie cellulaire vivante sans causer de toxicité ou affecter la viabilité des astrocytes. De même, l’utilisation d’une sonde fluorescente permet l’étiquetage rapide et efficace des organites endolysosomaux acides pour le suivi de la dynamique des organites et des astrocytes. Les données en accéléré de l’imagerie peuvent être utilisées pour générer des kymographes qui suivent le mouvement de la cargaison dans le temps et l’espace.
Dans ces kymographes, le mouvement antéograde de la cargaison indiquée est représenté par des trajectoires avec des pentes négatives, tandis que le mouvement rétrograde est représenté par des trajectoires avec des pentes positives. Les vésicules stationnaires apparaissent sous forme de trajectoires verticales. Dans cette analyse, la quantification du flux d’une cargaison spécifique à travers une zone de l’astrocyte a révélé des différences dans le pourcentage de particules modales parmi les cargaisons qui sont probablement représentatives de leur motilité normale de la ligne de base dans la région de l’astrocyte dans lequel les films ont été acquis.
La cartographie précise du changement dans la position X et Y le long de l’échelle de temps complète pour chaque particule obtenue à partir du kymograph peut également être utilisée pour évaluer d’autres paramètres de mouvement, tels que la vitesse de chargement et la longueur de course. Comme ce protocole exige des cultures d’astrocytes de haute qualité et un étiquetage efficace des cargaisons, le temps d’incubation et le calendrier d’acquisition du réaccfection transfection devraient être ajustés pour chaque plasmide ou cargaison d’intérêt. Ce protocole peut être modifié pour caractériser les événements de transport dans les astrocytes en réponse aux dommages cellulaires, à la toxicité, aux mutations pathogènes, à l’activité synaptique ou aux changements dans l’environnement intra ou extracellulaire.
