L’absorption et le métabolisme des acides aminés sont essentiels pour la spécification, la différenciation et la formation osseuse des ostéoblastes. Ce protocole fournit une méthode rapide et sensible pour évaluer l’absorption des acides aminés. Notre protocole utilise des acides aminés radiomarqués pour quantifier l’absorption des acides aminés.
C’est une méthode bon marché, sensible et rapide qui peut être facilement modifiée pour différentes conditions. Ce protocole peut facilement être modifié pour évaluer l’absorption d’autres nutriments radiomarqués comme le glucose et les acides gras dans une variété de tissus ainsi que dans les cellules primaires ou transformées. Pour commencer, plaquer cinq fois 10 à la quatrième cellule ST2 dans chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 12 puits en milieu alpha MEM supplémentée en FBS, pénicilline et streptomycine.
Plaquer des puits supplémentaires de cellules pour quantifier le nombre de cellules par condition pour les normalisations. Ensuite, incuber les cellules dans un incubateur de culture cellulaire humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours jusqu’à confluence. Après incubation, aspirez le milieu et lavez les cellules deux fois avec un millilitre de PBS à pH 7,4.
Ensuite, aspirez le PBS avant de laver les cellules une fois avec un millilitre de HEPES ou KRH de Krebs-Ringer. Incuber des cellules avec 0,5 millilitre de KRH fraîchement préparé contenant quatre microcuries par millilitre de milieu de travail de glutamine tritiée L34 pendant cinq minutes. Après l’incubation, recueillir le milieu radioactif pour le distribuer dans le conteneur à déchets liquides.
Ensuite, lavez les cellules trois fois avec du KRH glacé pour mettre fin à la réaction. Ensuite, ajoutez un millilitre de dodécylsulfate de sodium à 1% à chaque puits et triturez le mélange 10 fois pour lyser et homogénéiser les cellules. Ensuite, transférez les lysats cellulaires dans un tube de 1,5 millilitre et clarifiez le lysat en centrifugeant à une vitesse minimale de 10 000 G pendant 10 minutes.
Transférer le surnageant dans un flacon à scintillation contenant huit millilitres de la solution de scintillation et lire l’activité radio et le nombre de comptes par minute à l’aide du compteur à scintillation. À partir des plaques non radioactives restantes des cellules, trypsiniser, remettre en suspension et compter les cellules pour estimer le nombre de cellules dans les cultures radioactives lysées. À l’aide d’un hémocytomètre, compter le nombre de cellules par puits non radioactif pour chaque condition expérimentale.
Pour déterminer l’absorption d’acides aminés, rincer la moelle de l’os avant de peser la tige osseuse. Pour décellulariser l’os, faites bouillir un humérus dans du PBS à 100 degrés Celsius pendant 10 minutes. Équilibrez l’humeri vivant et bouilli dans un millilitre de KRH pendant 30 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius.
Ensuite, incuber séparément les os témoins expérimentaux et bouillis dans du KRH fraîchement préparé contenant quatre microcurries par millilitre d’arginine triciée L234 pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré le milieu radioactif, mettez fin à la réaction en lavant l’humérus trois fois avec un millilitre de KRH glacé. Transférez chaque os dans un tube de 1,5 millilitre avec 500 microlitres de tampon RIPA.
Homogénéisez ensuite l’humérus et le tampon RIPA en hachant 100 fois avec des ciseaux, suivi d’une sonication à 35% d’amplitude et d’une impulsion seconde pendant 10 secondes. Clarifié le lysat par centrifugation pendant 10 minutes à 10 000 fois G à température ambiante. Après centrifugation, transférer 200 microlitres du surnageant dans des flacons à scintillation contenant huit millilitres de solution de scintillation.
Lire l’activité radio à l’aide du compteur de scintillation. Les propriétés cinétiques de l’absorption in vitro de la glutamine tritiée par L34 et des cellules ST2 confluentes ont été évaluées en présence ou en l’absence d’acide méthylaminé isobutyrique sodique ou de lithium. L’élimination du sodium a entraîné une réduction de 90% de l’absorption de glutamine.
La présence de lithium a augmenté l’absorption de glutamine de 2% par rapport à l’état sans sodium. Alors que l’acide méthylamino isobutyrique n’a pas affecté l’absorption de glutamine. Les contributions estimées en pourcentage des systèmes A, N, L ou ASC et gamma plus L ont indiqué que la majeure partie de l’absorption de glutamine est médiée par les systèmes ASC et gamma plus L.Le système N est responsable d’environ 2% de l’absorption de glutamine dépendante du sodium.
Et le système A a montré 0% de contribution et d’adoption. L’absorption d’arginine tritiée X-VIVO L34 dans l’huméri néonatal bouilli et vivant a été analysée sur une période de deux heures. L’absorption d’arginine a augmenté linéairement tout au long de l’expérience et de l’humérium vivant.
L’humérus bouilli n’a pas montré d’augmentation dynamique de l’absorption d’arginine dans l’expérience. L’analyse représentative montre l’absorption normalisée et corrigée de l’arginine. Il est important de faire bouillir l’os controlatéral comme témoin actif.
Cette étape est essentielle car la matrice osseuse peut absorber des acides aminés radioactifs, ce qui entraîne des résultats inexacts. Le protocole nous a permis de confirmer la cinétique d’absorption des acides aminés à la fois in vitro et in vivo.
