Ce travail a été soutenu par la subvention du National Institutes of Health (HL115578 à A. Makino).

La recherche sur des souris a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université de l&#39;Arizona et a été réalisée selon l&#39;Institut national de la santé (NIH) des lignes directrices. NOTE: Les articles 1, 2 et 3 doivent être effectuées la veille de l&#39;expérience que l&#39;installation. 1. Solutions Préparation <ol><li> un tampon de CD31 (50 ml) <ol><li> Ajouter 50 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS) à un tube de 50 ml. Peser 0,05 g de sérum-albumine bovine (BSA) et 0,037 g d&#39;acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) et les ajouter au tube de 50 ml et mettre le tube en rotation pendant environ 1 h jusqu&#39;à dissolution de la poudre. Ajuster le pH à 7,4, filtrer à travers un filtre de 0,2 um dans un nouveau tube de 50 ml, et stocker à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></li><li> Une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec du HEPES (500 ml) <ol><li> Ajouter 1.1915 g de HEPES faire 10 HEPES mM dans une solution HBSS et bien mélanger. Mesurer le pH et ajuster à 7,4. Filtrer et conserver à 4˚C. </li></ol></li><li> 1x solution de Kreb (1 L) <ol><li> Ajouter 100 ml de solution de 10 × Kreb [Table 1] pour doubler l&#39; eau distillée dans un ballon de 1 litre. Peser 2,1 g de bicarbonate de sodium et 2 g de D-glucose et ajouter au flacon. Mélanger et ajuster le volume total à 1 L. </li><li> Solution à bulles avec 95% O 2/5% CO 2 gazeux pendant 30 min et une solution de filtre à l&#39; intérieur du capot. Conserver à 4 ° C et garder sur la glace au cours de l&#39;expérience. </li></ol></li></ol> 2. Préparation des billes magnétiques <ol><li> Ajouter 1 ml de tampon de CD31 dans chaque tube de 1,5 ml (un tube par échantillon). Mélanger les moutons anti-rat perles de IgG et ajouter la quantité appropriée à chaque échantillon [Tableau 1]. Agiter les tubes vigoureusement 30 fois et les placer dans la plaque magnétique pendant 1 min d&#39;agitation. Ouvrez les tubes tandis que sur la plaque et vider les solutions dans un seau. </li><li> Ajouter 1 ml de tampon de CD31 dans chaque tube. Ajouter 2 ul Rat anti-souris CD31 anti-corps à chaque tube et tourner les tubes O / N à 4 ° C. </li></ol> 3. autoclavage <ol><li> Autoclave tous les outils de chirurgie et des embouts de pipette. Couper les extrémités des embouts de pipette de telle sorte que il y a des conseils avec 4 diamètres différents, de la plus large à la plus étroite. diamètres approximatifs pour les conseils sont de 3 mm, 2,5 mm, 2 mm et 1,5 mm respectivement. Couper les pointes et l&#39;autoclave la veille avec 30 min de la stérilisation à une température de 121 ° C. NOTE: Les articles 4-11 doivent être effectuées le jour de l&#39;expérience. </li></ol> 4. Solutions Préparation <ol><li> Préparer un tampon de lavage contenant 2% Fer-Fortified sérum de veau (IFCS) dans M199. Pour l&#39;imagerie, préparer 30 ml / souris. </li><li> Préparer la solution enzymatique (10 ml / échantillon). Peser 0,6 unité / ml de dispase et 1 mg / ml de collagénase de type II dans un tube de 50 ml. Ajouter M199 et faire tourner le tube à 4 ° C pendant 15 min. Filtrer à travers filtre de 0,2 um dans un nouveau tube de 50 ml inside le capot et garder à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li><li> Préparer HBSS / HEPES avec Héparine. Ajouter 10 ml de HBSS avec 10 mM de HEPES dans 15 ml tube. Ajouter 100 pi de Heparin au tube et maintenir à 4 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 5. laver les perles <ol><li> Sortez les tubes avec des perles du rotateur à 4 ºC et porter à la hotte. Placer les tubes dans la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Dump de la solution et ajouter un tampon de CD31 1 ml dans chaque tube. </li><li> Prenez les tubes de la plaque magnétique et agiter vigoureusement 30 fois. Mettre les tubes de retour dans la plaque magnétique et répéter pour un total de 3 lavages. Après avoir terminé, mettre les tubes de retour à 4c et de garder la rotation jusqu&#39;à utilisation. </li></ol> 6. Dissection <ol><li> Injecter les souris par voie intrapéritonéale avec 0,1 ml d&#39;héparine pour empêcher la coagulation du sang. Attendre 10 minutes, puis anesthésier les souris en utilisant une injection intrapéritonéale de 0,01 ml de pentobarbital. Vérifiez si la souris se sentla douleur en pinçant le pied. </li><li> Placez la souris sur un panneau de polystyrène avec la tête et tenir les bras avec des épingles. Utilisez des pinces et difficiles-coupe-ciseaux pour couper la peau à la région thoracique supérieure jusqu&#39;à la gorge. </li><li> Faire une coupe dans le centre de la cage thoracique juste au-dessus du diaphragme. Couper l&#39;os sur le côté et vers le haut vers la gorge pour former un triangle d&#39;exposer le cœur et les poumons. Couper l&#39;aorte juste au-dessus du diaphragme. </li><li> Tenez le thymus avec une pince sans tirer et utiliser des ciseaux pour couper tout tissu conjonctif soigneusement pour éliminer les poumons et le cœur ensemble. Placer les tissus dans un bécher avec 1 × Kreb de, secouer avec une pince et transfert à boîte de 6 cm avec 1 x Kreb de. </li><li> Retirer les lobes du poumon à l&#39;aide de ciseaux et des pinces. Insérer un cathéter stérile 20 G dans l&#39;aorte. Rincer le sang dans le système circulatoire coronarien avec du HBSS / Héparine. Faire une petite incision dans le ventricule, secouer le cœur et transférer dans un tube de M199 de l&#39;échantillon. Garder les tubes sur la glace. </li></ol><p<html> class = &quot;jove_title&quot;&gt; 7. La digestion du tissu <ol><li> Transférer le coeur dans une boîte de 6 cm, rempli avec 10 ml de solution d&#39;enzyme et de hacher en petits morceaux avec des ciseaux. Placez les plats dans l&#39;incubateur à 37 ° C pendant 15 min. Agiter matériaux digérés par pipetage de haut en bas 30 fois à travers une pointe avec une extrémité coupée pour permettre au tissu de passer à travers plus facile. </li><li> Remettez-le dans le 37 ºC incubateur pendant 15 min. Répétez l&#39;agitation trois fois, chaque fois à l&#39;aide des embouts de pipette de plus grandes ouvertures les plus étroites et 15 minutes d&#39;incubation entre chaque. </li><li> Après la dernière 15 minutes d&#39;incubation, prélever des échantillons sur et dans la hotte. solution Pipet haut et en bas 30 fois en utilisant la pointe de la pipette avec l&#39;ouverture la plus étroite et passer à travers un tamis de 40 um de la cellule dans un nouveau tube de 50 ml. </li><li> Laver le plat avec un tampon de lavage de 10 ml en utilisant une pipette de 10 ml et transfert sur tamis cellulaire. Mettre les tubes de 50 ml dans la centrifugeuse et un essorage à 400 g pendant 10 min à température ambiante. </li></ol>itre &quot;&gt; 8. Lavage et Conjugaison avec des perles <ol><li> Retirer le surnageant sans perturber le culot. Laver deux fois les cellules avec du tampon de lavage 5 ml. </li><li> Obtenir un des préalablement préparé tubes de 1,5 ml avec des perles et des travaux sur un tube à la fois. Mettez un tube de 1,5 ml dans la plaque magnétique, secouez 3 fois et l&#39;ouvrir. </li><li> Après la dernière centrifugation, éliminer autant que possible surnageant sans perturber le culot. Dissocier les amas de cellules en tapotant vigoureusement. </li><li> Ajouter un tampon de lavage de 1 ml dans le tube de 50 ml et mélanger les cellules avec une pipette de 1 ml. Vider la solution provenant du tube de 1,5 ml et ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans le tube de 50 ml à billes. Feuilletez les tubes 30 fois puis tourner à 4 ° C pendant 30 min. </li></ol> 9. Préparation pour la culture cellulaire / Imagerie <ol><li> Préparer des chambres pour le placage des cellules. Ajouter une solution de gélatine (5% p / v, 300 ul) à la chambre pour enrober la surface et laisser incuber pendant 30 min à 37 ° C. Après incubation, remla gélatine ove et sécher la surface. </li><li> Sortez les tubes avec billes / cellules après 30 min de rotation et de mettre dans la plaque magnétique à l&#39;intérieur du capot. Agiter pendant 2 min, vidage et ajouter un tampon de lavage de 1 ml. </li><li> Prenez des tubes de la plaque, agiter vigoureusement 30 fois puis flick 30 fois. Remettez-les dans la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Répétez 4 fois pour un total de 5 lavages, mais avec 1 min en secouant sur la plaque. </li><li> Après le dernier lavage, prendre un tube et travailler sur chacun des tubes à la fois. Agiter 30 fois puis feuilletez 30 fois. Mettez-le sur la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Dump et ajouter 1 ml 20% des médias IFCS CE (préchauffé à 37 ° C). </li><li> Agiter vigoureusement 30 fois puis flick 30 fois. Régler la pipette 500 pi et pipeter de haut en bas 10 fois. Transférer 500 ul à chaque chambre. </li><li> Mettez à 37 ºC incubateur et laisser O / N. Le lendemain, laver les cellules avec 10% des médias FBS CE. </li></ol> 10. Préparation de blot (WB) Les échantillons occidentaux <ol><li> Take les tubes avec billes / cellules après 1 h de rotation. Mettez-les dans la plaque magnétique et agiter pendant 2 min. Dump surnageant et ajouter 1 ml de HBSS froid. Agiter vigoureusement 30 fois puis flick 30 fois. Répéter deux fois pour 3 lavages, mais avec 1 min en secouant sur la plaque. </li><li> Après le dernier lavage, mettre des tubes sur la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Retirer le tampon en utilisant la pipette et lyser les cellules pour WB en utilisant une méthode décrite précédemment 11,12. lysat Collected contient habituellement environ 30 ug de protéine. </li></ol> 11. Imaging <ol><li> Laver les cellules 3 fois avec des milieux, avec un volume final de 250 pl pour une chambre. Ajouter 1,5 ul de Dil acLDL aux cellules. De ce point, maintenir les cellules dans l&#39;obscurité. </li><li> Incuber pendant 3,5 heures à 37 ° C. Ajouter 1,5 pi de Hoechst, bien mélanger et laisser incuber pendant 30 min à 37 cellules ˚C.Wash avec PBS et fixer avec 4% paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Laver deux fois avec du PBS et bloquer avec 5% de BSA-PBS pendant 30 min à la température ambiante. Laver deux fois avec 1% de BSA-PBS. Diluer BS-lectine-FITC en utilisant 1% de BSA-PBS à une concentration de 2 pg / ml et ajouter 300 pi à chaque chambre. </li><li> Mettez la chambre sur l&#39;agitateur orbital à température ambiante pendant 30 min. Laver avec du PBS 3 fois. </li><li> Visualiser les cellules sous le microscope à fluorescence avec des temps d&#39;exposition de 200 ms pour FITC (de coloration à la lectine, un marqueur CE excitation / émission à 488 nm / 519 nm), 30 ms pour le DAPI (Hoechst, une coloration, une excitation / émission nucléaire à 358 nm / 461 nm), et 300 msec pour TRITC (acLDL coloration, un marqueur CE, excitation / émission à 557 nm / 576 nm). Acquérir des images en utilisant un objectif 20X. </li></ol>

<ol>
	<li>Michiels, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+functions.">Endothelial cell functions.</a> J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).</li><li>Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+in+focus:+endothelial+cell.">Cells in focus: endothelial cell.</a> Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91, 3527-3561 (1998).</li><li>Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+function+and+dysfunction:+testing+and+clinical+relevance.">Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance.</a> Circulation. 115, 1285-1295 (2007).</li><li>Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+vascular+endothelial+cells+from+murine+heart+and+lung.">Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung.</a> Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).</li><li>Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+connexin40+is+associated+with+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice.">Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).</li><li>Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+murine+tissue.">Isolation of endothelial cells from murine tissue.</a> J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).</li><li>van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+endothelial+cells+from+fresh+tissues.">Isolation of endothelial cells from fresh tissues.</a> Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).</li><li>Nolan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+signatures+of+tissue-specific+microvascular+endothelial+cell+heterogeneity+in+organ+maintenance+and+regeneration.">Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration.</a> Dev Cell. 26, 204-219 (2013).</li><li>Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+pulmonary+endothelial+cells+from+neonatal+mice.">Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-GlcNAcase+overexpression+reverses+coronary+endothelial+cell+dysfunction+in+type+1+diabetic+mice.">O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).</li><li>Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VDAC:+old+protein+with+new+roles+in+diabetes.">VDAC: old protein with new roles in diabetes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Les cellules endothéliales les plus largement utilisés dans la recherche sont des cellules humaines de la veine ombilicale endothéliales (HUVEC) en raison de leur commodité et la facilité de culture. Cependant, beaucoup de recherches , il faut disposer d&#39;un modèle physiologique atteint par l&#39;isolement des cellules endothéliales provenant d&#39; autres organes spécifiques 10. Les cellules endotheliales forment une population mineure de cellules dans le tissu cardiaque; leur isolement et leur cu...

Des modèles de souris de diverses maladies cardio-vasculaires et des troubles métaboliques portent des changements physiologiques et moléculaires qui sont similaires à celles observées chez les patients. En outre, la modification génétique de la souris est un outil puissant qui nous permet d&#39;étudier le rôle pathogène de gènes spécifiques dans le développement et la progression des maladies. De nos jours, le gène knock-in type de cellule spécifique ou souris -out sont facilement générés dans de nombreux laboratoires et la mesure de l&#39;ARNm et les niveaux de protéines dans des types cellulaires spécifiques est la première étape pour déterminer si les souris ont été vraiment génétiquement modifiées. Endothélium est une mince couche unique de cellules endothéliales (EC) qui lignées la paroi vasculaire intérieure. Les cellules endothéliales jouent un rôle essentiel dans la régulation de la tension vasculaire, la perméabilité vasculaire, et la nouvelle formation vasculaire 1,2. La dysfonction endothéliale est une caractéristique de nombreuses conditions pathologiques et des changements dans la fonction endothéliale peut conduire à diverses voituremaladies cardio- 3,4. Il est donc important d&#39;étudier la fonction des cellules endothéliales, dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Il y a plusieurs façons d&#39;isoler CEs 5-8 et la méthode d&#39;isolement doit être optimisée en fonction de quels tissus et les espèces seront utilisées. En effet , CEs provenant de différents tissus présentent un degré élevé d&#39;hétérogénéité par rapport à leurs marqueurs de surface et l&#39; expression des protéines 9. l&#39;isolement réussie des cellules endothéliales peut souvent être difficile et nécessite un certain degré de formation et de pratique. Une fois atteint, le procédé d&#39;isolement proposé dans ce protocole se révèle être stable et efficace. L&#39;objectif global de cette méthode est d&#39;obtenir la souris CEs coronaire (MCECs) de haute qualité et la quantité. Même si la quantité de cellules recueillies à partir d&#39;un coeur est inférieure à cellules collectées à partir d&#39;autres tissus en utilisant d&#39;autres techniques, cette technique fournit encore pariqualité ter. La pureté des cellules endothéliales dans la population résultante est supérieure à 90%. Ainsi, cette technique serait idéal pour les applications qui reposent sur les cellules endothéliales purement isolées telles que l&#39;imagerie cellulaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="876">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:239px;">BSA</td>
			<td style="width:251px;">Sigma</td>
			<td style="width:108px;">A3311-10G</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3026801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4034-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Sheep anti-rat IgG beads&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F-410L</td>
			<td style="width:280px;">DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rat anti-mouse PECAM Antibody&#160;</td>
			<td>BD Pharmigen</td>
			<td>550274</td>
			<td>BD Biosciences</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IFCS&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30072.04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">M199</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>MT10060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dispase (Neutral Protease)</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td>
			<td>LS02109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase Type II&#160;</td>
			<td>Worthington Biochemical Corp./Fisher</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycerol&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Igepal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>13021-50ml</td>
			<td>I3021-50 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0044-1ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8340-1 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3149-100KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS&#160;</td>
			<td>Fisher/Mediatech</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Valine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V1255-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGS</td>
			<td>BD</td>
			<td>356006</td>
			<td>Corning</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Fisher/Mediatech</td>
			<td>MT-30-002-Cl</td>
			<td>MT-30-002-CI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of mouse coronary endothelial cells

cellules endothéliales tapissent la paroi interne des vaisseaux sanguins et jouent un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire, la perméabilité vasculaire, et la nouvelle formation vasculaire. le dysfonctionnement des cellules endothéliales est impliquée dans le développement et la progression de nombreuses maladies cardiovasculaires, y compris une maladie cardiaque ischémique. Pour examiner la fonction et la caractérisation des cellules endothéliales coronaires, l&#39;isolement des cellules est la première étape et elle nécessite une grande pureté et en quantité pour effectuer des expériences ultérieures. Ce protocole décrit une méthode efficace pour isoler les cellules endothéliales coronaires de souris adulte. Le cœur de la souris est disséquée et hachée en petits morceaux. Après la digestion du coeur en utilisant la dispase II et de la collagénase, les cellules sont lavées et incubées avec des billes magnétiques qui sont conjuguées avec un anticorps anti-CD31. Les billes avec les cellules endothéliales sont lavées plusieurs fois et sont prêts à utiliser dans diverses applications, y compris l&#39;imagerie et de biologie moléculaire experiments. L&#39; isolement efficace donne environ 10 4 cellules par un seul cœur avec plus de 90% de pureté.

L&#39;isolement réussie des cellules endothéliales coronaires d&#39;un coeur de la souris donne généralement autour de 10 4 cellules avec plus de 90% de pureté avec une forme de pavés. Pour une population pure de cellules endothéliales, des précautions doivent être prises tout au long du protocole afin d&#39;assurer un environnement stérile exempt de toute contamination. L&#39;apparition de cellules allongées ou des cellules agrandies dans la population indique une ...

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Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolement de cellules de souris coronaire endothéliales

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

isolation-of-mouse-coronary-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

11.1K vues.  University of Arizona, Tucson. This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Vidéo: Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Recherche

Biologie

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

L&#39;isolement des cellules endothéliales valvulaires

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolement et culture de cellules endothéliales pulmonaires des souris néonatales

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolement des cellules endothéliales embryonnaires ventriculaires

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Isolation de microvasculaire endothéliale des artères de résistance Tubes souris

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolement des cellules endothéliales murines Valve

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

L&#39;isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Isolement de murin coronaire vasculaires cellules de muscle lisse

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolement et culture des cellules endothéliales aortiques primaires des porcs miniatures

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...