Ce protocole vise à obtenir des ARN spécifiques de types cellulaires de haute qualité à partir d’un petit nombre de cellules dans un tissu complexe sans tri cellulaire. Il utilise un modèle murin récemment disponible qui permet aux chercheurs d’isoler un ARN lié à un ribosome en utilisant l’extraction des BPL. La méthode convient également pour isoler les ARN liés aux ribosomes de toutes les cellules exprimant l’EGFP.
Pour commencer, ajoutez deux millilitres de tampon de travail d’homogénéisation à froid glacé à un ensemble de broyeur de tissus en verre. Placez rapidement l’échantillon congelé dans le broyeur et homogénéisez le tissu en 30 coups sur glace à l’aide d’un pilon lâche. transférer l’homogénat dans un tube à fond rond de deux millilitres et centrifuger à 12 000 g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Transférez ensuite le surnageant dans un nouveau tube de deux millilitres sans perturber la pastille, en réservant 100 microlitres comme entrée. Incuber le surnageant avec l’anticorps anti-GFP à quatre degrés Celsius sur un rotateur d’extrémité sur extrémité pendant la nuit. Transférer le mélange d’homogénate et d’anticorps dans un nouveau tube à fond rond de deux millilitres contenant des billes de protéines g lavées et incubé à quatre degrés Celsius sur rotateur à 24 tr / min pendant deux heures.
Séparez les billes magnétiques du surnageant à l’aide d’un rack magnétique. Enregistrer le surnageant comme fraction négative qui contient les ARN dans les cellules EGFP négatives et les ARN dans les cellules EGFP positives qui ne sont pas liées aux ribosomes. Ajouter un millilitre de tampon de lavage à haute teneur en sel aux perles et vortex brièvement le tube pour laver les perles.
Placez ensuite le tube dans un rack magnétique. Retirez le tampon de lavage et répétez les étapes de lavage deux fois de plus pour obtenir le complexe ARN ribosome des billes à partir de cellules EGFP positives. Incuber les billes avec 50 microlitres de tampon d’extraction du kit d’isolement d’ARN dans un ThermoMixer pendant 30 minutes pour libérer les ARN des billes.
Séparez les billes avec un support magnétique et transférez le surnageant dans un tube de 1,5 millilitre. Centrifuger le tube à 3000 g pendant deux minutes. Ensuite, pipeter le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.
Pour préconditionner la colonne de purification de l’ARN, pipeter 250 microlitres de tampon de conditionnement sur la colonne de purification et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Puis centrifuger la colonne à 16 000 g pendant une minute. Pipeter un volume égal d’éthanol à 70% dans l’extrait cellulaire et bien mélanger par pipetage.
Pipeter jusqu’à 200 microlitres du mélange dans la colonne de purification d’ARN préconditionnée. Pour réduire la perte d’échantillons ne remplissez pas la colonne à plus de 80% de sa capacité. Répétez cette étape plusieurs fois jusqu’à ce que tous les ARN soient collectés dans la même colonne de chaque fraction.
Centrifuger la colonne pendant deux minutes pour lier l’ARN à la membrane de la colonne. Continuez ensuite la centrifugation pendant 30 secondes. Jetez le flux et pipeter 100 microlitres de tampon de lavage dans la colonne.
Centrifuger pendant une minute, puis éliminer le flux. Pipette 75 microlitres de solution d’ADN se mélangent directement dans la membrane de la colonne de purification. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
Ensuite, pipeter 40 microlitres de lavage tamponner un dans la colonne et centrifuger pendant 30 secondes supplémentaires. Ignorez le flux. Introduire à la pipette 100 microlitres de tampon de lavage deux dans la colonne et centrifuger à 8 000 g pendant une minute.
Ignorez le flux. Acheter PET 100 microlitres de tampon de lavage deux dans la colonne et centrifuger à 16 000 g pendant deux minutes. Éliminer l’écoulement et recentrifuger la même colonne à 16 000 g pendant une minute pour éliminer toute trace de tampon de lavage.
Transférer la colonne dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. pipette 12 microlitres d’eau libre de RNase directement sur la membrane de la colonne de purification en veillant à ce que l’embout de la pipette ne touche pas la membrane. Incuber à température ambiante pendant une minute et centrifuger à 1000 g pendant une minute.
Puis à 16 000 G pendant une minute pour éluer l’ARN. Utilisez un bioanalyseur pour évaluer la qualité et la quantité de l’ARN extrait. Conservez les ARN dans un congélateur à 80 degrés ou envoyez-les pour une analyse plus approfondie.
Les souris porteuses des deux allèles génétiques génétiquement modifiés, Gli1-CreERT2 et NuTRAP, on nous injecte du tamoxifène une fois par jour, tous les deux jours pour trois injections. L’analyse par immunofluorescence des tissus prélevés montre que l’EGFP a été exprimé dans les cellules interstitielles des testicules. L’EGFP a également été trouvé dans les cellules capsulaires surrénales chez les souris Gli1-CreERT2, NuTRAP.
Chez Sonic Hedgehog-CreERT2, souris NuTRAP La population cellulaire positive EGFP réside dans le cortex externe de la glande surrénale sous la capsule, confirmant l’expression des cellules pré-exprimant l’EGFP. Après l’extraction des ARN spécifiques du type cellulaire, l’ARN extrait a été envoyé pour analyse de microréseau. Les résultats ont montré qu’environ 3000 gènes ont été enrichis dans la fraction positive, par rapport aux gènes dans la fraction négative, tandis qu’environ 4 000 gènes ont été enrichis dans la fraction négative.
Parmi les gènes différentiels exprimés, les gènes associés aux cellules de Leydig Hsd11b1 et Hsd3b6 ont été enrichis dans la fraction positive. Dans la fraction négative, les gènes associés à la cellule Sertoli Desert Hedgehog et Gstm6 ont été enrichis. Seuls quelques gènes exprimés différentiellement ont été identifiés en comparant la fraction négative avec l’entrée.
La RT-PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour confirmer l’expression de gènes clés dans les fractions positive et négative. Semblable à ce qui a été trouvé dans le test de microréseau, les enzymes stéroïdogènes 3-bêta-hydroxystéroïde déshydrogénase et l’enzyme de clivage de la chaîne latérale du cholestérol ont été enrichies dans la fraction positive. Pendant ce temps, le marqueur cellulaire Sertoli SRY box facteur de transcription neuf et le marqueur de cellules germinales synaptonemal complexe protéine trois ont été enrichis dans la fraction négative.
Lors de la tentative de ce protocole, il est important de préparer un nouveau tampon de travail d’homogénéisation Ajouter le DTT, la ribonucléase recombinante cycloheximide et le cocktail inhibiteur de protéinase à la solution mère d’homogénéisation uniquement avant utilisation. Il est également important de préparer des tampons frais à faible teneur en sel et à haute teneur en sel avant utilisation.
