Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la thérapie du microARN au rein, ce qui reste un défi. Le principal avantage de cette technique est qu’elle a permis la thérapie des microARN imitant le rein sans provoquer de réponse à l’interféron ou d’instabilité génétique. Commencez par dissoudre 10 microlitres de PEI-NPs dans 90 microlitres de solution de glucose à 5% dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.
Ensuite, faites tourbillonner doucement le tube et tournez vers le bas. Mélanger 50 microlitres de miARN synthétisés artificiellement dissous dans 100 micromolaires d’eau sans nucléase avec 50 micromolaires de solution de glucose à 10% dans des tubes microcentrifuges de 1,5 millilitre. Vortex doucement le tube et tourner vers le bas.
Ce processus donne miARN dissous dans une solution de glucose à 5%. Ensuite, mélangez 100 microlitres de PEI-NPs dans une solution de glucose à 5% et 100 microlitres de miARN mimic dans une solution de glucose à 5%. Vortex doucement le tube et tourner vers le bas.
Incuber le mélange pendant 15 minutes à température ambiante pour préparer un complexe stable d’imitation miARN PEI-NPs. Dissoudre deux microlitres de PEI-NPs dans 98 microlitres de solution de glucose à 10% dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Vortex doucement le tube et tourner vers le bas.
Ajoutez ensuite 100 microlitres de miARN marqué Cy3 imitant 100 microlitres de PEI-NPs dans une solution de glucose à 10% et vortex doucement le tube. Incuber le mélange pendant 15 minutes à température ambiante pour préparer un complexe stable de miARN marqué PEI-NPs-Cy3. Placez la souris UUO tête la première dans un tube centrifuge de 50 millilitres sans anesthésie, puis placez la queue à travers un trou préparé dans le bouchon.
Remplissez une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 30 avec 200 microlitres de complexe mimique marqué PEI-NPs-Cy3 et injectez le complexe via la veine de la queue de la souris. Ensuite, faites une incision dans la peau, les muscles et les côtes avec des ciseaux chirurgicaux et des forceps pour exposer le cœur. Après avoir pratiqué une incision dans l’oreillette droite, injectez du PBS dans le ventricule gauche jusqu’à ce que la couleur des reins devienne jaune pâle.
Cela indique que tout le corps de la souris est perfusé avec PBS. Après avoir recueilli les reins, retirez les capsules rénales et lavez-les deux fois avec du PBS. Incorporer les échantillons de tissus rénaux dans un composé OCT et les congeler dans de l’azote liquide.
Utilisez un cryostat pour préparer les sections et montez les sections sur des lames de verre recouvertes de silane. Fixez-les avec 4% de paraformaldéhyde et lavez doucement les lames deux fois avec du PBS. Enfin, visualisez la coloration de fluorescence par microscopie à fluorescence à grossissement 100x et 400x et un logiciel d’imagerie approprié.
L’image représentative montre la structure du complexe mimique PEI-NPs-miARN. L’administration et les effets de miRNA-146a-5p-mimic utilisant les IPE-NP dans la fibrose rénale sont représentés dans ces images. L’analyse par microscopie fluorescente a montré que l’injection de PEI-NP par veine arrière pouvait délivrer le miARN mimimic à l’espace tubulo-interstitiel.
Chez les souris atteintes de fibrose rénale produites par UUO, cela comprenait des cellules tubulaires rénales qui n’ont pas de forme régulière dans le rein et le glomérule. L’analyse qRT-PCR a montré que l’injection de miARN-146a-5pmime PEI-NPs-miRNA-146a-5p induisait une surexpression significative de miRNA-146a-5p dans le rein. L’analyse histologique avec coloration rouge Sirius est montrée ici.
L’analyse par microscopie fluorescente a montré que l’injection de PEI-NP dans les veines postérieures pouvait délivrer un miARN mimique au glomérule et à l’espace tubulo-interstitiel dans les reins de souris modèles de rein diabétiques in vivo. De plus, l’analyse qRT-PCR a montré que l’injection de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic induisait une surexpression significative de miRNA-181b-5p dans le rein. L’analyse histologique avec coloration périodique acide-Schiff a montré que l’injection de PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic une fois par semaine de 10 à 20 semaines inhibait la progression de la maladie rénale diabétique chez la souris.
L’administration et les effets de l’imitation PEI-NPs-miRNA-5100-mimic chez des souris modèles d’insuffisance rénale aiguë produites par une lésion de reperfusion ischémique sont présentés ici. Les données de l’analyse par microscopie fluorescente qRT-PCR pour évaluer les effets de surexpression de miRNA-5100 après injection de PEI-NPs-miRNA-5100-mimic et l’analyse histologique du rein coloré à l’hématoxyline-éosine sont représentées dans ces images. Les IPE-IP injectés par la veine de la queue deux jours avant la procédure de lésion de reperfusion ischémique, ou IRI, empêchent la progression de la lésion rénale aiguë induite par l’IRI.
Lors de l’exécution de cette technique, préparez des sections de cinq micromètres d’épaisseur qui comprennent autant de tissu rénal que possible. Vous pouvez également préparer des sections de sept micromètres d’épaisseur.
