Ce protocole fournit une stratégie avantageuse pour enrichir les cellules souches de la glande lacrymale pour la régénération et la reconstruction de la glande lacrymale. Les cellules souches des glandes lacrymales présentent une capacité d’expansion à long terme et un potentiel de différenciation. Le principal avantage de cette technique est que le milieu de culture des cellules souches de la glande lacrymale est sans sérum, ce qui montre l’énorme valeur pour la réparation de la glande lacrymale Commencez par obtenir une souris mâle BALB / c euthanasiée de six à huit semaines et coupez la peau derrière l’oreille pour exposer la glande lacrymale et le tissu conjonctif qui l’entoure.
Décollez le tissu conjonctif par dissection contondante à l’aide d’une pince à épiler et retirez la glande lacrymale. Immergez les glandes lacrymales dans un plat de six centimètres avec quatre millilitres d’éthanol à 75% pendant 10 secondes et rincez immédiatement deux fois avec une solution de PBS de 10 millimolaires. Coupez les glandes lacrymales en petits fragments d’environ un millimètre cube.
Transférez-les dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 millilitres et traitez les tissus avec 500 microlitres de 25 unités par millilitre de dispase et 500 microlitres de 0,1% de collagénase I pendant une heure à 37 degrés Celsius. Traiter les fragments de glande lacrymale avec un millilitre de 0,05% de trypsine EDTA pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius et dissocier les fragments en cellules individuelles en pipetant à plusieurs reprises. Filtrez la suspension à travers un filtre de 70 micromètres, collectez le filtre dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 millilitres et centrifugez à 150 fois G pendant cinq minutes.
Après centrifugation, retirer le surnageant, ajouter 10 millilitres de solution pbS de 10 millimolaires pour laver la pastille cellulaire et centrifuger la suspension à 150 fois G pendant cinq minutes. Répétez le lavage de la pastille de cellule. Ensuite, retirez le surnageant et ajoutez un millilitre d’un rapport de 1:1 du Modified Eagles Medium de Dulbecco et du F-12 de Ham pour remettre en suspension les granulés cellulaires.
Ajouter 20 microlitres de matrice gel de cellule souche de la glande lacrymale matrice matrice au centre du puits d’une plaque de 24 puits. Utilisez une pointe de pipette pour l’étendre à un cercle d’environ six à huit millimètres de diamètre et incuber le mélange pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius pour pré-enduire le puits. Utilisez un compteur de cellules pour déterminer le nombre de cellules et ajoutez 40 microlitres de milieu de cellules souches de glande lacrymale, ou LGSCM, avec un total de 10 000 cellules dans 40 microlitres du gel matriciel.
Mélangez-les doucement avec une pipette. Utilisez une pipette pour laisser tomber soigneusement 80 microlitres du mélange sur la zone pré-enduite dans chaque puits de la plaque de 24 puits. Incuber le mélange pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius et ajouter 600 microlitres de LGSCM.
Changez le milieu de culture dans chaque puits une fois tous les deux jours. Après sept jours de culture, recherchez des sphères LGSC de 100 à 300 micromètres de diamètre au microscope inversé. Utilisez ce protocole pour isoler et cultiver des cellules souches primaires de la glande lacrymale de souris Rosa26 et NOD.
Après sept jours de culture, retirez bien le milieu de culture de la sphère. Désagrégez les sphères LGSC par incubation en 20 microlitres de 10 unités par millilitre de dispase et 100 microlitres de PBS de 10 millimolaires pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Transférer la suspension dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et centrifuger à 150 fois G pendant quatre minutes.
Retirez le surnageant. Traiter les sphères avec un millilitre de 0,05% de trypsine EDTA pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius Ajouter un millilitre d’inhibiteur de 0,05% de trypsine et pipeter à plusieurs reprises pour neutraliser la trypsine et dissocier les sphères en cellules simples. Centrifuger à 150 fois G pendant cinq minutes et retirer le surnageant pour granuler les LGSC.
Ajouter un millilitre de LGSCM pour remettre en suspension la pastille de cellules souches de la glande lacrymale et plaquer les cellules comme démontré précédemment. Si vous effectuez la première procédure, prolongez le temps de culture des LGSC de sept à 14 jours avec le système de culture de cellules souches de la glande lacrymale pour une différenciation aléatoire. Pour la deuxième procédure, modifiez le rapport du gel matriciel au LGSCM de 1: 1 à 1: 2 au début de la culture de cellules souches de la glande lacrymale pour la différenciation des cellules canalaires.
Ensemencez les cellules souches de la glande lacrymale dans la matrice pour l’induction pendant 14 jours. Pour la troisième procédure, après le passage, remplacez le LGSCM par LGSCM 10% FBS pour la différenciation des cellules acineuses. Induire une différenciation pendant 14 jours.
Après une semaine de culture, Kr14 et Ki67 ont été exprimés dans toutes les sphères formées par les cellules souches des glandes lacrymales. Les sphères ont atteint un diamètre de 100 micromètres. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a montré une cellularité au septième jour.
Les facteurs d’enrichissement des cellules souches de la glande lacrymale obtenues après sept jours de culture primaire et de sous-culture indiquaient que les cellules enrichies par cette méthode avaient une forte capacité proliférative. Dans ce système, les cellules souches de la glande lacrymale pourraient être passées plus de 40 fois tout en conservant les caractéristiques des cellules souches. Les cellules souches des glandes lacrymales ont été induites à former plus de bourgeons par le sérum bovin fœtal et une faible proportion de gel matriciel.
La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a indiqué que le sérum bovin fœtal pouvait inciter les sphères à produire plus de structures cavitantes. Après l’injection orthotopique de cellules souches de la glande lacrymale Rosa chez des souris NOD, de nouveaux lobules lacrymaux se sont formés à côté des glandes lacrymales. La plupart des lobules étaient composés de cellules acineuses matures avec une expression élevée d’AQP5 et il y avait une formation de canal intralobulaire avec une faible expression d’AQP5.
La quantité de sécrétion de larmes du côté de l’injection de cellules souches de la glande lacrymale Rosa était plus élevée que du côté témoin, mais inférieure à celle des souris de type sauvage Le gel matriciel et son mélange connexe doivent toujours être conservés sur de la glace avant utilisation et le tube de microcentrifugation et les embouts en contact avec le gel matriciel doivent être pré-refroidis. Le système fournit un modèle idéal pour une étude plus approfondie des cellules souches de la glande lacrymale, la réparation de la glande lacrymale et le dépistage médicamenteux des maladies de la glande lacrymale.
