Le protocole réduit considérablement le nombre de copies d’ADN mitochondrial dans l’ovocyte. Cela pourrait être bénéfique pour le clonage intra-espèce. Cette méthode réduit le nombre de copies d’ADN mitochondrial dans les ovocytes bovins de plus de 90%, ce qui pourrait réduire l’incidence de l’hétéroplasmie mitochondriale dans les embryons clonés.
Laura Adams, une doctorante de mon laboratoire, fera une démonstration de la procédure. Pour commencer, à l’aide d’une pipette, prélever les ovocytes matures sélectionnés dans la goutte de HSOF et les placer dans le tube de 1,5 millilitre contenant 50 microlitres de la solution de HSOF CB. Centrifuger les ovocytes à 15 000 fois G pendant 12 minutes.
Pendant que les ovocytes sont en cours de centrifugation, préparez la plaque de bisection. Pour cela, commencez par faire un motif sur le couvercle d’une boîte de Petri de 60 millimètres en utilisant 20 microlitres par goutte, et couvrez entièrement les gouttes avec de l’huile minérale. À l’aide d’un marqueur à pointe mince, marquez les lignes sous le plat.
Couvrir le plat avec un couvercle opaque jusqu’à ce que la centrifugation soit terminée pour éviter les changements d’osmolarité des microgouttes. Dès que la centrifugation est terminée, utilisez une pipette de 200 microlitres pour recueillir les ovocytes dans la solution et déplacez-les dans une partie vide d’une nouvelle plaque de recherche avec quatre gouttes HSOF de 400 microlitres, avant de laver les ovocytes à travers des gouttes HSOF. Allumez l’étage de chauffage à 38,5 degrés Celsius.
Utilisez une pipette buccale pour déplacer les ovocytes centrifugés de la goutte HSOF vers la goutte T2 supérieure gauche de la plaque de bisection. Ensuite, lavez les ovocytes à travers les trois gouttes suivantes sur la rangée supérieure. Déposez les ovocytes dans l’une des gouttes de pronase, en assurant qu’il y a peu ou pas de contact entre eux.
Observez les ovocytes jusqu’à ce qu’il y ait une déformation claire des zonae pellucidae. Une fois qu’une seule zone ovocytaire pellucide s’est déformée, déplacez cet ovocyte vers la goutte T2 voisine. Répétez l’opération lorsque d’autres ovocytes se déforment, jusqu’à ce que tous les ovocytes aient été retirés de la pronase et placés dans la goutte de T2.
Observez les ovocytes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une fine couche de la zone pellucide. Lavez les ovocytes à travers les trois gouttes suivantes dans la rangée, puis déposez-les en lignes verticales dans les gouttes CBT20. Commencez avec moins d’ovocytes dans les lignes verticales et augmentez le nombre d’ovocytes par goutte à mesure que les compétences de bisection progressent.
Concentrez-vous sur la première goutte CBT20 la plus à gauche qui contient des ovocytes et utilisez une pipette buccale pour faire pivoter les ovocytes de sorte que la partie dense en mitochondries de chaque ovocyte soit tournée vers ou loin du bras du microscope. Placez la pointe de la microlame à gauche de l’ovocyte supérieur, en ligne avec l’espace directement au-dessus de la partie dense en mitochondries. En gardant l’extrémité de la lame au même endroit, abaissez soigneusement la lame pour la couper tout au long de l’ovocyte.
Assurez-vous que l’ooplast dense en mitochondries et l’ooplast réduit en mitochondries sont de la même taille et que la lame est coupée en deux dans le segment le plus clair de l’ovocyte centrifugé. Lorsque vous soulevez la lame, assurez-vous que la même ligne est maintenue et que la pointe de la lame reste au même endroit, puis soulevez doucement la pointe de la plaque. Répétez les étapes de bisection pour tous les ovocytes dans la première goutte de bisection.
Si des ovocytes sont présents dans des gouttes supplémentaires, orientez et coupez en deux les ovocytes restants. À l’aide d’une pipette buccale, recueillir les ooplastes réduits en mitochondries de la première goutte de bisection. Placez-les dans la goutte T20 de gauche située dans la rangée inférieure de la plaque.
Répétez l’opération pour toutes les gouttes de bisection restantes. À l’aide d’une pipette buccale, recueillir les ooplastes denses des mitochondries de la première goutte de bisection. Placez-les dans la goutte T20 de droite située dans la rangée inférieure de la plaque.
Répétez l’opération pour toutes les gouttes de bisection restantes. Récupérez la boîte à quatre puits T10 de l’incubateur. À l’aide d’une pipette buccale, déplacez tous les ooplastes réduits en mitochondries vers le MR bien étiqueté et déplacez les ooplastes denses en mitochondries vers le M.Replacez la plaque à quatre puits dans l’incubateur contrôlé par le dioxyde de carbone.
Laisser les ooplastes reposer pendant au moins 30 minutes avant la quantification de l’ADNmt. Pour une bisection réussie, les échantillons d’ovocytes entiers et d’ooplastes denses en mitochondries ont des valeurs de tomodensitométrie similaires. Les échantillons d’ooplastes réduits aux mitochondries ont des valeurs de tomodensitométrie plus élevées que les échantillons des deux autres groupes.
Pour une bisection infructueuse, la bisection ne réduit pas efficacement la teneur en ADNmt dans les ooplastes réduits par les mitochondries. Suite à la production d’une courbe standard et à l’utilisation des formules de nombre de copies d’ADNmt fournies, une réduction moyenne de l’ADNmt ovocyte de 93,88% a été obtenue à l’aide de ce protocole. Orienter correctement chaque ovocyte dans la goutte de bisection, couper précisément chaque ovocyte en deux et trier avec précision les ooplastes sont toutes des étapes critiques à suivre pour obtenir des résultats positifs.
Deux ooplastes peuvent être fusionnés avec une cellule somatique. Les triplés fusionnés peuvent ensuite être activés chimiquement et cultivés en tant qu’embryons reconstruits.
